地塞米松抑制子宫内膜异位症体外模型血管生成的实验研究

摘要

子宫内膜异位症（endometriosis EM，内异症）是由有活性的子宫内膜组织在子宫体之外的部位生长、浸润并出现周期性出血而引起痛经、不孕、性交痛等症状的临床常见病，严重影响着妇女的健康和生活。本病多见于30岁左右的育龄妇女，典型病例根据病史和体征不难诊断，但有些患者的症状与体征可不相称，例如有明显痛经者，妇科检查并无异常发现，而盆腔有明显包块者，却可以毫无症状，因而造成该疾病诊断上的困难。同时，EM的治疗也是一个棘手的难题。现在的临床治疗无外乎针对疼痛及不孕这两个严重影响生活质量的症状，主要方法包括药物治疗和手术治疗。目前治疗EM应用最为广泛的药物是GnRH-a，该类药物通过在垂体水平与GnRH受体的结合，迅速耗竭GnRH，引起GnRH分泌的降调节，进而造成卵巢的低雌激素状态和闭经，从而使残留的内膜异位病灶萎缩退化，同时还具有促进内膜细胞凋亡，抑制其增殖等作用。长期应用GnRH-a可引起阴道干燥、骨质疏松、潮热和心绪烦躁等低雌激素症状，患者的接受性及依从性差，而且一旦停药，随着雌激素水平的恢复，相当多患者的病情会复发。手术治疗内异症，可以祛除病灶、恢复盆腔解剖，但对部分患者的手术价值还存在一定争议。同时，手术后加用药物治疗虽在短期内可能提高治疗效果，但仍不能避免或减少术后复发。因此，疾病的复发仍然是目前子宫内膜异位症治疗的难点。其原因在于发病机制的不确定，缺乏以病因为靶点的治疗方法。所以人们不得不对EM的发病机制进行更深入的研究，以期获得更好的治疗方法。 近年来，新生血管的形成成为了研究EM发病原因和发病机制的热点。EM中新血管生成的证据有：①腹腔镜下见异位病灶内部和周围有大量特征性的新生血管，腹腔局部的血管生成活跃；②盆腔异位病灶的形态学研究证实，病灶基底部毛细血管的数量和面积显著增多，新鲜的红色病灶较陈旧的棕色病灶具有更丰富的毛细血管；③盆腔外异位内膜病灶存在于血管生成活跃的部位；④病理形态学上EM最显著的特征就包括腹腔血管生成增加，异位内膜种植和粘连形成；⑤免疫组化研究发现异位内膜的腺上皮细胞周围微血管较为密集且管腔直径小，提示异位内膜血管生成旺盛；⑥患者的腹腔液及异位病灶中多种血管生成因子明显增高；⑦患者内皮细胞增殖指数明显高于对照组。总之，当脱落的子宫内膜组织附着在腹膜或其它部位时，异位内膜组织本身及其周围组织新的血供的建立和维持，才是异位子宫内膜组织种植、存活和内异症发生的基本条件。因此，可以说，异位子宫内膜组织的转移、种植、生长等类似肿瘤转移的生物学行为，是内异症发病的关键。异位子宫内膜病灶的形成及生长必须依赖新生血管的形成，血管生成机制已成为内异症公认的重要发病机制。目前已有学者尝试用血管生成抑制因子针对内异症进行有关抗血管生成治疗的研究，初步显示了良好效果。因此，抗血管生成可能成为治疗内异症的有效途径。 核转录因子-κB（NF-κB）是一种广泛存在于细胞的多显性转录因子，是现今所知的转录因子中最重要的内皮细胞活化调节因子，1986年由美国麻省理工学院癌症研究中心的Baltimore和麻省Whitehead生物医学研究所的Rwiansen发现。它在促进新生血管生成中发挥着重要作用。多种刺激使。NF-κB激活后，可促进细胞增殖和抗凋亡的能力，并可以上调许多与免疫、炎症反应以及新生血管形成有关的因子的表达及功能。已有实验证实，内异症患者的在位、异位内膜中NF-κ3mRNA和蛋白表达水平均升高，NF-κB参与了子宫内膜异位症细胞粘附、侵袭和血管形成的病理生理过程。所以，如果可以抑制NF-κB基因的表达，就可以诱导血管内皮细胞凋亡，并针对粘附、侵袭及血管形成这三阶段全方位的达到抗血管生成的目的，进而抑制内异灶的生长，治疗子宫内膜异位症。 糖皮质激素作为临床常用抗炎药物，在对肿瘤血管生成抑制作用的研究中显示其具有抑制血管生成作用，但尚无糖皮质激素与内异症相关关系的研究。如果能将其运用于内异症，抑制内异灶血管生成，那么它将为内异症提供一个简单而快速的治疗途径。 目的： 1.为深入研究糖皮质激素在抑制内异症血管生成方面的疗效，首先，观察糖皮质激素对血管内皮细胞的影响。以血管内皮生长因子（VEGF）刺激人血管内皮细胞株Eahy926，然后，以地塞米松（Dexamethasone，DEX）为实验用药，将其作用于该细胞，观察地塞米松对Eahy926增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制。 2.建立子宫内膜异位症鸡胚尿囊膜模型，将地塞米松置于血管相对密集区，观察其对血管生成的影响。为进一步研究地塞米松在子宫内膜异位症动物模型上的治疗作用打下基础。　　方法： 1.无菌条件下快速复苏人血管内皮细胞株（Eahy926），用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM（低糖）培养基培养。实验开始时，先将细胞分为四组：A组：阴性对照组；B组：单纯DEX刺激组；C组：单纯VEGF处理组；D组：VEGF预处理后加DEX刺激组。（VEGF预处理组即先用浓度为10ng/ml的VEGF刺激Eahy926血管内皮细胞生长48小时），然后再以较高浓度（100μmol/L）地塞米松作用于各组细胞24小时后用RT-PCR和Western Blotting分别检测其NF-κB mRNA和蛋白表达水平，采用细胞凋亡的荧光检测法（Heochst 33342）检测地塞米松对Eahy926的形态学改变，MTT法观察地塞米松对Eahy926增殖的抑制作用，流式细胞仪检测技术检测地塞米松引起的Eahy926凋亡率改变。 2.将EM患者在位子宫内膜碎屑接种于8天胚龄的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）上，建立子宫内膜异位症鸡胚尿囊膜模型（EM CAM）。实验分组：①单纯空白组：10枚，不接种子宫内膜碎屑，在开窗后即予无菌贴膜封口；②空白载体组：10枚，不接种子宫内膜碎屑，以无菌明胶海绵为载体，给予生理盐水0.1ml/d；③接种组：20枚鸡胚，将1mm×1mm×1mm子宫内膜碎屑接种至CAM相对无血管区，以无菌明胶海绵为载体，每只给予生理盐水0.1ml/d；④接种治疗组：20枚鸡胚，将1mm×1mm×1mm子宫内膜碎屑接种至CAM相对无血管区，以无菌明胶海绵为载体，每只每天给予0.1ml DEX（浓度为100umol/L）。利用Image-Pro Plus 6.0软件，定量血管新生面积、蛋壳开窗处对应的CAM面积，计算出血管新生面积与CAM面积的比值，从而观察地塞米松对其血管生成的抑制效果。　　结果： 1.MTT实验中，各组间光吸收值有显著性差异（P=0.000）。实验组相对于单纯VEGF处理组及阴性对照组的细胞增殖抑制率分别为44.38％和40.76％；单纯DEX刺激组相对于单纯VEGF处理组及阴性对照组的细胞增殖抑制率分别为17.48％和12.11％。 2.流式细胞仪检测结果显示，阴性对照组细胞凋亡率为1.18％，单纯DEX刺激组为5.01％，单纯VEGF处理组为0.2％，VEGF预处理后加DEX刺激组则为19.32％。各组间凋亡率相比，有显著性差异（P=0.016）。 3.Heochest荧光染色结果显示，阴性对照组、单纯VEGF组及单纯DEX刺激组三组细胞均未见明显凋亡小体，而VEGF预处理后再加DEX刺激组则可观察到染色质凝聚块分散在细胞质中形成凋亡小体。 4.用RT-PCR检测各组细胞中NF-κB mRNA表达，阴性对照组及单纯DEX刺激组NF-κB mRNA表达水平相似，单纯VEGF刺激组NF-κB mRNA表达水平升高，而VEGF预处理后加DEX刺激组NF-κB mRNA水平则较单纯VEGF刺激组降低。Westernblot检测中，4组均显示在相对分子质量65KD大小的条带。阴性对照组及单纯DEX刺激组细胞质中能检测到NF-κB蛋白表达，且表达水平相同，单纯VEGF刺激组细胞质NF-κB蛋白表达水平增高，而VEGF预处理后加DEX刺激组NF-κB蛋白水平则较单纯VEGF刺激组降低。 5.肉眼观察，接种组CAM新生血管数明显增多，呈放射状；接种治疗组CAM新生血管数明显减少；空白对照组可见CAM上的载体周围血管呈类似树叶的叶脉状分布。应用Image-Pro Plus6.0计算血管新生面积与CAM面积的比值，结果表明，与接种组、单纯空白组及空白载体组比较，接种治疗组血管新生面积明显减少（P=0.000）。接种组和单纯空白组、空白载体组之间差异有统计学意义（P=0.000）；单纯空白组和空白载体组之间差异无统计学意义（P=0.087）。　　结论： 1.较高剂量（100umol/L）的地塞米松对VEGF预刺激的人血管内皮细胞增殖起抑制作用，并诱导其凋亡。 2.VEGF预刺激后地塞米松能抑制NF-κB mRNA表达，并使Eahy926中NF-κB蛋白表达减少。这说明地塞米松可能是通过抑制细胞NF-κB mRNA及蛋白表达从而抑制Eahy926增殖并诱导其凋亡。 3.EM鸡胚绒毛尿囊膜模型实验表明EM在位子宫内膜具有一定的促进血管生成的能力，进一步证实了EM的血管生成理论。同时也证实，地塞米松具有抗子宫内膜细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜中血管生成的作用，为进一步探讨地塞米松在子宫内膜异位症动物模型中的治疗作用奠定了实验基础。

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结论

参考文献

文献综述：核转录因子-κB与子宫内膜异位症的治疗

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