太空环境对链球菌菌体多糖分子表达的影响

摘要

众所周知，浩瀚的太空疆域无垠，有着地面上难以比拟的环境条件。目前研究证实太空环境具有强辐射、高真空、微重力、高洁净等特点，存在着诱发生物体突变的多种因素。早在20世纪60年代，美国、苏联等科学家就进行了太空环境对病毒、细菌、植物染色体等研究，发现空间环境辐射可导致多种生物体DNA链断裂、细胞分化异常及致突变率较高等特点。其后世界各航天强国陆续进行太空环境对其他有生命物质影响的探索，在宏观层面多为诱变物的性状、功能方面的研究，而微观方面也大多是蛋白质及基因方面的研究。他们证实了太空环境除具改变生物体性状及功能的作用外，还可以诱导基因的突变及影响蛋白质的表达。复合糖在生物的分化、繁殖、信号传导、免疫机制等方面具有重要的生物功能。然而，至今太空环境对多糖分子表达影响方面的研究尚少。太空环境作为一个全新的区域，已成为世界各国空间科学研究的热点，其在能源、制药等多方面发挥着重要作用。有关资料表明，若到太空环境中制药一个月的产量可相当于地球上30-60年的产量。我国就有几种药品是通过卫星载入太空后取得的，具有非常好效果。由此可见，利用太空环境的诱变效应用来制药将有着非常广阔的前景。多糖分子是生物体中包括动物、植物以及微生物在内的所有有生物质重要的组成成分，它有着维系生命的重要功能，具有组成骨性支架、组合受体、调节机体免疫等众多生物活性。微生物中如细菌中存在大量的多糖分子，它有着十分重要的各种功能。据研究其具多种生物学活性，在刺激骨髓造血、引起巨噬细胞增殖及凋亡、制作多糖菌苗、抗体及治疗多种疾病等方面表现出非常高的使用价值。Α-溶血性链球菌作为链球菌种属的一种，也称为甲型溶血性链球菌，为条件致病菌，其发酵产物糖肽具有较高的生物学价值，在抗肿瘤、刺激骨髓造血及调节自身免疫等方面有重要作用。凝集素是一类无免疫原性、能识别糖链结构的蛋白质，其结合的专一性类似于抗原抗体反应。根据凝集素的糖结合特异性，凝集素可分为七类：（1）D-甘露糖或（D-葡萄糖）组；（2）N-乙酰葡萄糖胺组；（3）N-乙酰半乳糖组；（4）D-半乳糖；（5）L-岩藻糖组；（6）唾液酸组；（7）复合糖组。凝集素具有许多重要的生物学活性，其在抗营养性、防卫功能、细胞成熟和分化标记、肿瘤诊断及免疫组织化学等方面发挥着重要的作用。另外，植物凝集素作为一种重要的天然产物，是分离纯化和研究糖复合物结构与功能的重要工具，是研究糖和蛋白质相互作用机制的理想模型。其在转基因抗虫、生物固氮、药物开发、骨髓移植及疾病鉴定等多个方面将有着广泛的应用。 研究目的: 在不同种类的凝集素中各选取一种有代表性的凝集素，分别是ConA、WGA、SNA、RCA-Ⅰ及PHA，应用改良的过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记凝集素，利用凝集素的糖结合特性，检测α-溶血性链球菌菌体中上述5种凝集素识别多糖分子的水平，了解进入太空环境前及进入太空环境后链球菌菌体内多糖分子表达的状况，旨在从多糖分子水平了解太空环境是否具有菌种的诱变作用，探讨太空环境是否对链球菌菌体多糖分子的表达有影响，并且是否能为细菌多糖生物产品的筛选、增进性能或提高产量等方面提供新的途径，以及是否能为太空诱变菌生物功能的研究提供新的实验依据。 材料和方法: 1.菌种太空链球菌种由陕西太空生物制药工程技术研究中心提供。系在普通α-溶血性链球菌种中，挑选产量高、敏感性大、变异幅度广的菌株处理后，置入培养基封装，装入神舟飞船返回舱内，进行数天轨道运行（近地点高度200公里、远地点高度350公里）后返回。然后经过多次搭载不同的卫星进入太空环境供其诱变，并反复挑选得到的正变异太空菌种。将上述两菌种经过钴60照射9000GY后灭活，保存于-80℃冰箱超低温保存，待检。 2.菌种的破碎，蛋白多糖分子的提取采用超声波破碎法破碎细菌，离心取上清，然后应用盐溶法提取蛋白多糖分子，上清中加入硫酸铵至饱和度为60%～90%，继续搅拌10～30 min，4℃静置3～5 h，离心，将沉淀溶于蒸馏水，采用Sevage法脱除游离蛋白，离心收集上清液，旋转蒸发脱除残余溶剂，4℃透析，冷冻干燥，得蛋白多糖粉末。计算细菌破碎率及蛋白多糖获取率。 3.凝集素的标记采用改良的过碘酸钠法用HRP标记凝集素，标记后经过Sephadex G-200层析柱，行蛋白凝胶电泳检测酶标凝集素标记后通过亲和层析法的过滤效果，测酶标抗体标记率及ELISA测效价。 4.多糖分子的检测检测方法蛋白多糖分子——HRP标记凝集素法（类似直接法ELISA），利用菌体蛋白多糖分子包被96孔酶标板，加入标记好的HRP-凝集素，充分结合，洗脱未结合的酶标凝集素，通过TMB-H2O2溶液显色，测吸收值，菌体中的多糖分子越多，与HRP标记的凝集素就结合越多，经过显色后OD值就越高，反之就越低。 5.统计学处理文中所有OD值数据均以均数±标准差（-x±s）表示，用SPSS13.0软件包检验分析，采用的具体统计学方法为独立样本t检验，结果以P<0.05认为差异具有统计学意义，若P>0.05认为差异无统计学意义。 研究内容及结果: 1.菌种的破碎，蛋白多糖分子的提取 结果：根据公式计算细菌相对破碎率=（1-超声后细菌沉淀湿重/超声前细菌沉淀湿重）、蛋白多糖得率=蛋白多糖/细菌重量×100%；得出细菌相对破碎率为99%，蛋白多糖得率：地面链球菌为1.36%，太空链球菌为1.58%。 2.凝集素的标记 结果：HRP-凝集素标记率（测OD403nm/OD280nm得标记率）分别为0.73、0.78、0.75、0.73及0.75；用ELISA检测酶标凝集素效价分别为1：1000、1：000、1：1000、1：800和1：600。 3.两菌种多糖分子得检测结果 （1）地面普通链球菌菌体蛋白多糖中测得ConA相关末端N-高甘露糖型多糖分子的OD值为：0.97±0.05，太空型链球菌菌体蛋白多糖中该多糖分子的OD值为1.18±0.03，阳性对照组OD值为1.46±0.05，阴性对照组OD值为0.05±0.00，两菌种OD值比较，P值为0.000，小于0.05，差异有统计学意义。 （2）地面普通链球菌菌体蛋白多糖中测得WGA相关末端GlcNAc多糖分子的OD值为：1.16±0.04，太空型链球菌菌体蛋白多糖中该多糖分子的OD值为1.16±0.03，阳性对照组OD值为1.46±0.03，阴性对照组OD值为0.05±0.00，两菌种OD值比较，P值为0.967，大于0.05，差异无统计学意义。 （3）地面普通链球菌菌体蛋白多糖中测得SNA相关末端Neu5Aca2-6Gal多糖分子的OD值为：0.56±0.03，太空型链球菌菌体蛋白多糖中该多糖分子的OD值为0.75±0.04，阳性对照OD值为1.35±0.04，阴性对照组OD值为0.05±0.00，两菌种OD值比较，P值为0.000，小于0.05，差异有统计学意义。 （4）地面普通链球菌菌体蛋白多糖中测得RCA-Ⅰ相关末端Galβ1-4 GlcNAc多糖分子的OD值为：1.19±0.06，太空型链球菌菌体蛋白多糖中该多糖分子的OD值为1.38±0.08，阳性对照组OD值为1.42±0.05，阴性对照组OD值为0.05±0.00，两菌种OD值比较，P值为0.001，小于0.05，差异有统计学意义。 （5）地面普通链球菌菌体蛋白多糖中测得PHA相关末端Gal-NAC多糖分子的OD值为：0.85±0.06，太空型链球菌菌体蛋白多糖中该多糖分子的OD值为0.84±0.05，阳性对照组OD值为1.44±0.06，阴性对照组OD值为0.05±0.00，两菌种OD值比较，P值为0.664，大于0.05，差异无统计学意义。 主要结论: 本实验通过应用改良的过碘酸钠法利用辣根过氧化物酶标记各种凝集素，采用超声波法行细菌破碎，盐溶法提取菌体蛋白多糖分子，然后根据凝集素能特异性检测相关多糖分子的原理，利用凝集素是一类无免疫原性、能识别糖链结构的蛋白质，其结合的专一性类似于抗原抗体反应，利用类似ELISA法的原理，用HRP标记的凝集素法检测检测两菌种蛋白多糖分子。本实验中选用ConA结合N-高甘露糖型多糖分子、WGA结合末端GlcNAc多糖分子，SNA可结合末端相关Neu5Aca2-6Gal多糖分子，RCA-Ⅰ结合末端Galβ1-4 GlcNAc多糖分子及PHA可结合末端Gal-NAC多糖分子的原理特性，检测普通型α-溶血性链球菌及太空型链球菌菌体内的多糖分子水平差异，研究两种链球菌体内多糖分子表达的情况， 结论显示： 1、从多糖分子水平证实了太空环境具有对α-溶血性链球菌的诱变作用； 2、实验证明太空环境对α-溶血性链球菌多糖分子的表达有选择性影响作用，能使ConA相关N-高甘露糖型多糖分子、SNA相关末端Neu5Aca2-6Gal多糖分子及RCA-Ⅰ相关末端Galβ1-4GlcNAc多糖分子的表达增加；对WGA相关末端GlcNAc多糖分子及PHA相关末端Gal-Nac多糖分子的表达无影响。 3、根据太空环境对细菌多糖分子表达的影响作用，为细菌多糖生物产品的筛选、提高性能或提高产量等方面提供新的可能途径，并为太空诱变菌生物功能的研究提供了新的实验依据； 4、太空环境对链球菌多糖分子表达影响的机制有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一节 太空诱变研究历史和现状

第二节 凝集素概述

第三节 细菌多糖研究现状

第四节 太空诱变研究的意义

第一部分 菌种的收集及细菌计数

材料与方法

结果

讨论

第二部分 细菌蛋白多糖的提取

材料与方法

结果

讨论

第三部分 凝集素辣根过氧化物酶的标记

材料与方法

结果

讨论

第四部分 菌体多糖分子的检测

材料与方法

结果

讨论

结 论

参考文献

综述 凝集素的药理活性及其与疾病的关系

附录 中英文对照缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明