COX-2及mTOR信号通路在Peutz-Jeghers息肉中的表达研究

摘要

背景/目的： Peutz-Jeghers综合征（PJS）是一种以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发息肉为特征的常染色体显性遗传病。既往研究认为PJS息肉病理属于错构瘤，癌变可能性小；近年来有报道PJS息肉为腺瘤样息肉，可发生癌变，但这个腺瘤样息肉是由错构瘤演变而来，还是PJS本身存在着错构瘤和腺瘤的不同临床亚型，尚无定论； PJS患者不仅消化道息肉的癌变风险率较高，而且常伴胃肠道外许多器官肿瘤，其家族的癌症发病率也较普通人群为高。PJS患者临床上以反复肠套叠、消化道出血和腹痛为主，胃肠道多发息肉经手术切除治疗后复发率高，严重威胁其健康和生命，给社会和家庭带来沉重负担。目前PJS相关致病基因、PJS息肉恶变机制未完全阐明，尚无干预措施能根治和预防PJS发病及息肉恶变的发生。 环氧合酶-2（Cyclooygenase，COX-2）是前列腺素合成过程中的关键限速酶，在肿瘤发生发展、转移、抑制凋亡及促进肿瘤血管生成等方面发挥重要作用，而COX-2的靶点又有特异性的抑制剂（NSAIDs等），已成为肿瘤的一种化学预防药；研究已表明COX-2高表达是结肠腺瘤一腺癌演变的早期事件[21]，流行病学研究证明服用COX-2选择性抑制剂和非选择性抑制剂可使患结肠癌的危险度降低[22]；目前研究发现COX-2在PJS裸鼠模型和PJS患者的错构瘤性息肉中表达增高[23-24]，但尚未在PJS息肉的恶变过程中进行评估。 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可接受生长因子、营养、能量等多种调控信号，是细胞生长和增殖的关键调节分子[25]，且在肿瘤的形成、发展过程，也起着重要作用[26]，因此把mTOR作为相关肿瘤的治疗靶点成为当前靶向治疗的一个研究新热点。mTOR抑制剂即雷帕霉素（Rapamycin）及其衍生物加来曲唑（temsirolimus，CCI-779），依维莫司（everolimus，RAD001）在肿瘤治疗中的作用已引起广泛关注，目前CCI-779已被FDA批准用于晚期肾癌的治疗，并成为原发性肝癌、胆管癌和食管癌、乳腺癌、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤的潜在靶向治疗药物[27-33]；此外，mTOR抑制剂亦成为结节性脑硬化症（TSC）、PTEN错构瘤综合症等良性肿瘤的潜在治疗药物[26，34]；近来，Michael N.等在细胞水平研究表明STK11（LKB1）的杂合性缺失或基因突变可引起mTOR信号通路的过度激活，提示mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物有望成为PJS的潜在治疗药物[35]。目前尚无mTOR信号通路在PJS息肉病理演变进程中的研究报道。 因此本课题在收集PJS患者资料及标本的基础上，对其进行临床病理特征分析，并初步探讨COX-2分子及mTOR信号通路在PJS息肉演变过程中的表达，为PJS息肉恶变的防治提供依据。 方法： 1.回顾性分析2001年-2008年来自19个家系26名PJS患者的临床特征及遗传特征，并对其74枚息肉进行部位、大小及组织学类型的分析，探讨PJ息肉的病理演变过程。 2.收集代表PJ息肉演化进程中不同阶段的组织标本：20例正常大肠粘膜、36枚错构瘤性PJ息肉、21枚腺瘤样变PJ息肉及2枚局灶性癌变的PJ息肉，另取20例结肠腺癌标本做对照；并分别进行蜡块制作和HE染色， 3.在连续切片上用免疫组化法检测COX-2的表达水平；用原位杂交法检测上述标本中mTOR的mRNA表达，用免疫组化法检测mTOR信号通路关键蛋白（mTOR、p-mTOR及S6K）的表达。 4.统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计数资料表达差异采用R×C X2检验，等级资料表达差异采用多组等级资料的秩和检验（Kruskal-Wallis H）。检验标准以P<0.05为有显著性差异。 结果： 1.26例患者中有明确家族史者占54%（14/26），散发病例占46%（12/26），且散发病例的后代仍可发病。 2.通过对26例PJS患者的74枚息肉进行组织学分析，发现3个阶段的PJ息肉，即68%（50/74）为错构瘤性PJ息肉、30%（22/74）为腺瘤样变PJ息肉和2.7%（2/74）局灶性癌变的PJ息肉，可推测PJ息肉存在着“错构瘤→腺瘤→腺癌”的演变过程。同时，通过在局灶性腺瘤样变的PJ息肉中进行Ki67分子的免疫组化染色，可将发生腺瘤样变的区域与正常上皮明显区分开来。 3.分析PJ息肉组织学类型、大小及部位的分布，显示78%（39/50）错构瘤性PJ息肉的直径在20mm以下，且广泛分布于全消化道；72%（16/22）腺瘤样变的PJ息肉直径在30mm以上，其中，45%（10/22）的腺瘤样变PJ息肉发生在乙状结肠，40%（9/22）发生在回盲部；介于20-30mm之间的PJ息肉共9枚，其中5枚为错构瘤性，3枚有局灶性腺瘤样变，1枚发生了癌变；另1枚癌变的PJ息肉直径在30mm以上。 4.COX-2的表达水平随着PJ息肉恶变的演化进程逐渐升高：COX-2在正常大肠粘膜表达阴性或者仅有15%（3/20）的低频率弱表达，在错构瘤性PJ息肉中COX-2表达开始增高，并随着正常粘膜→错构瘤性PJ息肉→腺瘤样变PJ息肉→大肠癌的演化过程，表达逐渐升高，经多组等级资料的秩和检验方法（Kruskal-Wallis H），差异具有显著性（X2=41.238，P=0.000）。 5、原位杂交实验结果显示：在正常大肠粘膜、错构瘤性PJ息肉、腺瘤样变PJ息肉及大肠癌组织中，mTOR的mRNA阳性表达率依次为15%（3/20）、47.2%（17/36）、61.9%（13/21）和80%（16/20），经R×C X2检验，差异具有显著性（X2=18.293，P=0.000）。 6、免疫组化结果显示mTOR、p-mTOR及S6K在PJS息肉演变各阶段的表达差异有显著性（X2值分别为9.927、22.508及8.034，P值分别为0.019、0.000及0.000，均<0.05），且p-mTOR和S6K在腺瘤样变PJ息肉和大肠癌中的表达阳性率分别为42.9%（9/21）、70%（14/20）和52.4%（11/21）、65%（13/20），明显高于正常粘膜组和错构瘤性息肉组的表达，阳性率分别为15.0%（3/20）、13.9%（5/36）和15.0%（3/20）、19.4%（7/36）。 结论： 1.本组资料中，46%（12/26）的PJS患者为散发病例，其后代也可能患病，不符合常染色体显性遗传病的遗传规律。 2.通过对74枚PJ息肉病理类型的分析及Ki67的组化染色，支持PJ息肉可能存在“错构瘤→腺瘤→腺癌”的演变途径。 3.本组研究提示大小为3cm以上且位于乙状结肠和回盲部PJ息肉恶变风险较高，介于2-3cm之间的PJ息肉已有恶变趋势。 4.COX-2的表达随PJ息肉恶变的演化进程逐渐升高：COX-2在错构瘤性PJ息肉中已表现出明显的高表达，推测其与PJ息肉的形成有关，并早期参与PJ息肉癌变，而且可能是息肉不断生长过程中的重要调控因子。 5.mTOR信号通路在PJ息肉恶变的演化进程中过度激活：mTOR信号通路的关键分子p-mTOR和S6K在发生了腺瘤样变和癌变的PJ息肉中表达较强，但在错构瘤性PJ息肉中几乎无表达，提示其可能为PJ息肉恶变发生的晚期事件，是PJ息肉恶变过程中的重要调节因子。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写对照表

声明

前 言

第一章Peutz-Jeghers综合征临床病理分析

引言

第一节材料与方法

1、实验对象

2、实验方法

3、主要实验试剂

第二节结果

1、临床资料分析(表1-1)

2、遗传特征分析

3、息肉病理特征分析(表1-2)

图表

第三节讨论

小结

第二章初步探讨COX-2及mTOR信号通路在PJ息肉病理演变过程中的表达

引言

第一节材料与方法

1、材料

2、实验方法

第二节结果

第三节讨论

小结

全文总结

参考文献

硕士期间发表论文

致谢

统计学证明