siRNA抑制CTGF表达对高糖诱导肾小管上皮细胞肥大和转分化的影响及机制

摘要

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常见并发症之一，也是终末期肾功能衰竭的主要原因之一。肾脏肥大是DN早期最重要的病理生理学特征，晚期则表现为纤维化。肾小管体积约占整个肾脏体积的90%，因而肾小管肥大在肾脏肥大中占有十分重要的地位。肾小管间质纤维化的进展程度则与肾功能的进行性下降密切相关。肾小管上皮细胞作为构成肾小管间质结构的主要细胞之一，在DN肾小管肥大及间质纤维化过程中扮演了重要的角色。肾小管上皮细胞的肥大及向间充质细胞转分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）现象是引起肾小管肥大，间质纤维化的重要原因。 本研究设想，通过检测高糖条件下培养的人肾小管上皮细胞CTGF、p27kip的mRNA及蛋白表达水平，ERK1/2、JAK2、STAT3磷酸化水平，α-SMA、E-cadherin的蛋白水平，细胞总蛋白含量及周期变化，探讨高糖诱导肾小管上皮细胞肥大及EMT的作用途径及可能的发生机制；通过构建可高效抑制CTGFmRNA表达的siRNA载体，在体外转染肾小管上皮细胞，观测抑制CTGF表达后对细胞肥大及EMT相关指标的影响，进一步探寻CTGF对肾小管上皮细胞肥大及EMT的诱导机制，为针对CTGF的RNA干扰（RNA interference，RNAi）治疗提供一定的实验基础。 第一章: CTGF基因特异性siRNA的设计、合成及表达载体的构建和鉴定 一、研究目的: 构建并鉴定稳定表达针对CTGF基因的siRNA的质粒。 二、研究方法: 1.根据人CTGF mRNA基因编码区序列，利用计算机辅助设计软件设计3条针对CTGF的siRNAs（siRNA-CTGF-1、siRNA-CTGF-2及siRNA-CTGF-3），和1条作为阴性对照的无关序列（siRNA-CTGF-neg）。并合成分别包含这4条siRNAs的短发夹状RNA（shRNA）的模板脱氧寡核苷酸序列。 2.将上述shRNA模板脱氧寡核苷酸序列分别插入pGenesil-1质粒，构建分别表达3种特异性siRNA的质粒（pshRNA-CTGF-1、pshRNA-CTGF-2、pshRNA-CTGF-3）和1种表达无关序列的质粒pshRNA-CTGF-neg。 3.重组质粒转化DH5α E.coli菌液，挑取单克隆菌落，摇菌，小量提取质粒后进行酶切及基因测序鉴定。对鉴定正确的细菌克隆进行大量质粒提取。 三、结果: 提取pshRNA-CTGFs质粒进行SalⅠ酶切鉴定。因在插入的目的基因片段里，我们设计了一个SalⅠ的酶切位点，重组后的质粒被SalⅠ酶切出一条约400bp的DNA小带，提示目的基因接入正确，质粒重组成功。 取各组抽提质粒送上海生工公司进行测序鉴定，测序结果表明分别插入siRNA-CTGF-1、siRNA-CTGF-2、siRNA-CTGF-3和siRNA-CTGF-neg的质粒插入片段与设计片段完全一致，表明重组成功。 四、结论: 利用pGenesil-1质粒成功设计并构建了表达针对CTGF mRNA的特异性siRNA的质粒载体。 第二章: siRNA表达载体转染人肾小管上皮细胞抑制CTGF表达的实验研究 一、研究目的: 研究针对CTGF的siRNA表达载体转染人肾小管上皮细胞株HK-2后对CTGF mRNA及蛋白表达的抑制效果。 二、研究方法: 1.HK-2细胞分高糖组及正常对照组分别在含葡萄糖4.5 g/L及1g/L的DMEM/F12完全培养基中传代培养，并于第24h、48h、72h、96h和20d收集细胞。以RT-PCR检测CTGF的mRNA表达水平，免疫细胞化学、Western blot检测CTGF蛋白表达水平。 2.以阳离子化合物jetPEITM为介导，将重组质粒分别转染入高糖组培养20天后的细胞，用空质粒载体做空白对照。各组细胞继续培养于高糖培养基中，分别于24、48、72、96h收集细胞，以RT-PCR检测CTGF的mRNA表达水平，免疫细胞化学、Western blot检测CTGF蛋白表达水平。挑选抑制效果最好的siRNA表达载体进行后续实验。 三、结果: 1.HK-2细胞在正常情况下表达CTGF极低，高糖刺激可显著上调细胞CTGF的mRNA及蛋白表达水平。 2.将表达siRNA-CTGF-1～3的质粒分别转染长期（20天）高糖培养的HK-2细胞，48h后测定CTGF mRNA表达，结果提示3条siRNAs均能显著抑制CTGF mRNA表达，但以siRNA-CTGF-1的抑制效率最高，转染细胞后CTGF mRNA水平同另外2条比较显著降低。 3.转染siRNA-CTGF-1的细胞24h时CTGF mRNA水平已出现降低，随着时间延长，抑制率随之增加，48h逐达到最大抑制效果，96h时仍显著低于空白对照组。 4.转染siRNA-CTGF-1的细胞CTGF蛋白表达水平随时间延长进行性下降。 四、结论: 高糖刺激可显著上调HK-2细胞CTGF的mRNA及蛋白表达水平。我们设计的3条针对CTGF基因的siRNA均能特异和高效地抑制高糖诱导的这一变化。其中以干扰靶基因序列436-454位点siRNA-CTGF-1的抑制效率最高。 第三章:高糖诱导HK-2细胞肥大和EMT的机制及siRNA沉默CTGF表达对其的影响 一、研究目的: 研究高糖诱导HK-2细胞肥大和EMT的作用途径及可能机制，并观察细胞转染siRNA-CTGF-1后对这一过程的影响。 二、研究方法: 1.HK-2细胞分6组培养：（1）正常对照组：细胞在含葡萄糖1g/L的DMEM/F12完全培养基中传代培养。（2）高糖组：细胞在含葡萄糖4.5g/L的DMEM/F12完全培养基中传代培养。（3）等渗对照组：细胞在含葡萄糖1g/L，甘露醇3.5g/L的DMEM/F12完全培养基中传代培养；（4）高糖+空白对照组：细胞转染空质粒pGenesil-1后培养于高糖DMEM/F12完全培养基中。（5）高糖+阴性对照组：细胞转染pshRNA-CTGF-neg后培养于高糖DMEM/F12完全培养基中。（6）高糖+siRNA-CTGF-1组：细胞转染pshRNA-CTGF-1后培养于高糖DMEM/F12完全培养基中。 2.分别于各组培养24、48、96h时收集细胞以Real-time荧光定量PCR检测各组CTGF、p27kip的mRNA表达水平。 3.分别于各组培养24、48、96h时收集细胞，以Western blot方法检测CTGF、p27kip、α-SMA、E-cadherin的蛋白表达水平。 4.分别收集各组培养30min，1h，24h，48h时的细胞，以Western blot方法检测磷酸化ERK1/2、磷酸化JAK2、磷酸化STAT3的水平。 5.MTT法检测各组细胞培养24、48、96h时的细胞增殖活力。 6.考马斯亮蓝法测定各组细胞培养24、48、96h时的细胞内总蛋白含量。 7.流式细胞分析技术检测各组细胞培养24、48、96h时的细胞周期分布。 三、结果: 1.高糖刺激可引起HK-2细胞的CTGF、p27kip的mRNA及蛋白表达水平显著升高；ERK1/2磷酸化激活；越来越多的细胞被阻滞于G1期；细胞增殖活力受抑制；细胞肥大主要指标胞内蛋白总含量进行性增高。 2.转染siRNA-CTGF-1能显著抑制高糖诱导HK-2细胞的CTGF、p27kip的mRNA及蛋白高表达，使磷酸化ERK1/2水平降低，更多的细胞由G1期进入S期，细胞增殖活力增强，细胞肥大主要指标胞内蛋白总含量降低。 3.高糖刺激可呈时间依赖性降低HK-2细胞的E-cadherin蛋白表达水平，与此同时出现α-SMA蛋白表达水平进行性升高，提示高糖可直接诱导肾小管上皮细胞发生EMT。 4.高糖刺激30min时即已显著升高磷酸化JAK2/STAT3水平，1h达峰值，且一直持续至48小时仍高于正常对照组。转染siRNA-CTGF-1能显著降低HK-2细胞的磷酸化JAK2/STAT3水平，同时伴有细胞EMT过程受抑。 四、结论: 证实了CTGF是介导高糖诱导肾小管上皮细胞肥大的重要因子，而这一作用是通过激活ERK1/2信号转导，上调p27kip转录水平，使增殖细胞周期停滞于G1期，从而抑制细胞的增殖引起的。针对CTGF的siRNA能通过降低ERK1/2活性，抑制p27kip表达，从而提高细胞增殖活力，明显减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞肥大。 证实高糖可以通过上调CTGF表达，继而激活JAK2/STAT3途径，引起肾小管上皮细胞发生EMT。而通过特异性siRNA抑制CTGF表达后可减轻高糖引起的JAK2/STAT3磷酸化激活，进而抑制肾小管上皮细胞EMT。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一章CTGF基因特异性siRNA的设计、合成及表达载体的构建和鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

附图

参考文献

第二章siRNA表达载体转染人肾小管上皮细胞抑制CTGF表达的实验研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三章 高糖诱导HK-2细胞肥大和EMT的机制及siRNA沉默CTGF表达对其的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文结论

攻读学位期间成果

致谢

统计学审稿证明