ZNF217基因真核载体的构建及其在卵巢浆液性囊腺癌的表达和功能研究

摘要

目前Tanner等人已经检测到卵巢癌患者中ZNF217基因发生扩增，表达增强，与卵巢癌的发生机制具有相关性，但目前对该基因的生物学特性尚不十分清楚。因此，本研究通过建立在前人的研究基础上，在20q13.2区域中筛选出与癌相关的ZNF217候选肿瘤基因，构建ZNF217基因真核载体稳定转染到卵巢癌细胞株尚，重点探讨该基因对浆液性卵巢癌增殖、黏附、侵袭、运动以及转移的影响和作用机制，阐明ZNF217基因在卵巢癌发生发展中的主要生物学功能，为探讨参与卵巢癌的发生发展的分子机制和基因功能以及相关信号通路调节奠定理论基础。并且，对临床手术患者进行追踪检查，了解患者卵巢癌术后生存时间，探讨ZNF217基因与患者的病理分级、组织分化、预后及生存时间是否相关，为早期诊断、靶向治疗提供理论依据。 方法: 1、真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-ZNF217的构建。 采用RT-PCR技术从人HO-8910卵巢癌细胞总RNA中扩增ZNF217cDNA基因全长，经过酶切签定后，克隆至pMD19-T easy，测序证实碱基序列无误后，再克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上，并转染到真核细胞，观察其在真核细胞中的表达。成功构建真核表达载体pEGFP-N1-ZNF217，可为进一步研究ZNF217基因的功能及作用机制奠定了基础。 2、ZNF217基因过表达对卵巢癌细胞生物学特性的影响 构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-ZNF217，利用阳离子脂质体Lipofectaming TM2000将pEGFP-N1-ZNF217导入卵巢上皮性癌细胞株HO-8910中，用空质粒载体做阴性对照。经G-418筛选获得抗性单克隆，挑取荧光强的克隆进行扩大培养，荧光定量RT-PCR和Western blotting鉴定转染后ZNF217基因在细胞中的表达；利用MTT法、流式细胞术、黏附、侵袭以及运动实验检测ZNF217基因表达增强对细胞体外增殖、细胞周期、黏附、侵袭及运动能力的影响。 3、建立整体可视化卵巢癌原位及转移动物模型 通过卵巢癌原位手术移植的方法建立卵巢癌原位动物模型，利用肿瘤细胞表达EGFP的特点，借助整体荧光体视镜结合IPP5.0软件采集、分析EGFP发出的荧光信号，在动物活体实时观察ZNF217基因对卵巢癌细胞致瘤能力的影响及利用可视化卵巢癌原位动物模型观察ZNF217基因对卵巢癌细胞体内转移能力的影响，分析ZNF217基因过表达的细胞对细胞增殖能力的影响；应用病理学方法对卵巢癌原位及转移动物模型进行评价和鉴定。 4、ZNF217基因与卵巢癌的生存率相关性及其预后评估 通过对44例卵巢浆液性囊腺癌的患者的5年临床追踪观察，回顾性分析临床资料，其中ZNF217基因阳性表达的患者26例，阴性患者18例，了解ZNF217基因表达阳性与临床分期，组织分化程度增加是否相关，比较ZNF217表达阳性的患者生存时间与ZNF217基因阴性的患者是否存在差异，以及两者预后有何不同。 5、统计学分析 应用SPSS13.0软件进行数据分析，临床资料的回顾性分析采用主要采用t检验；运动实验、侵袭实验、克隆形成率实验以及黏附实验采用one-way ANOVA检验的方法，体外增殖实验采用one-way ANOVA和析因方差分析检验，两组不同时间的肿瘤体积的比较采用重复测量的方差分析。 结果: 1、真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-ZNF217的构建。 采用RT-PCR技术从人HO-8910卵巢癌细胞总RNA中扩增ZNF217cDNA基因全长，经过酶切签定后，克隆至pMD19-T easy，测序证实碱基序列无误后，再克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上，构成重组质粒体pEGFP-N1-ZNF217后，然后通过脂质体转染到真核细胞，观察其在真核细胞中的表达。通过成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-ZNF217，为进一步研究ZNF217基因的功能及作用机制奠定了基础。 2、ZNF217基因表达增强后对卵巢癌细胞生物学特性的影响 MTT法观察ZNF217基因表达增强后体外细胞的增殖情况，经析因方差分析进行统计学分析，与pEGFP-N1/HO-8910和HO-8910相比，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910细胞增殖能力增强，三组差异具有显著性（F=32.050，p=0.000）。说明ZNF217基因表达水平增强后，肿瘤细胞体外生长能力明显增强。各组细胞与时间组交互效应显著重复因素7个不同水平的细胞之间差异均具有显著性意义（F=44.814，p=0.000），细胞与时间有交互效应具有统计学意义（F=37.960，p=0.000），这些结果均说明ZNF217表达水平增强后，能显著性地增强卵巢癌细胞的体外生长能力。 流式细胞技术检测ZNF217基因表达增强前后的对体外细胞增殖及细胞周期的影响，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910、pEGFP-N1/HO-8910及HO-8910三组细胞的S期细胞平均比例分别为：22.4%，15.7%和13.0%。数据显示pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910的S期细胞比例比对照组pEGFP-N1/HO-8910和HO-8910多（F=13.208，p=0.006），ZNF217基因表达增强后S期细胞增多说明ZNF217基因有增强细胞增殖的作用。另外，三种细胞的流式分析结果中均未见到细胞凋亡峰的存在，说明ZNF217基因的表达变化并没有导致细胞凋亡的出现。 细胞黏附实验结果表明，与pEGFP-N1/HO-8910和HO-8910相比，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910细胞黏附能力明显增强，差异具有显著性（F=95.487，P=0.000）。 体外侵袭小室检测ZNF217基因表达增强前后细胞侵袭能力的改变，结果显示，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910细胞的侵袭能力比pEGFP-N1/HO-8910和HO-8910细胞的侵袭能力有明显的增强，差异具有显著性（F=29.247； P=0.000），说明ZNF217过表达可增强对卵巢癌细胞的体外侵袭能力。 运动小室检测ZNF217基因表达增强前后细胞运动能力的改变，结果显示，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910细胞的运动能力高于pEGFP-N1/HO-8910和HO-8910细胞的运动能力，差异具有显著性（F=13.530； P=0.001），说明ZNF217过表达增强了卵巢癌细胞的体外运动能力。 通过建立卵巢癌可视化动物模型，我们可以连续观察ZNF217基因表达增强前后致瘤能力和转移能力的影响。将pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910和pEGFP-N1/HO-8910细胞分别接种在6只裸鼠的皮下，通过30d连续的观察，经重复测量数据的方差分析进行统计学分析得出差异具有统计学意义，两组之间差异有统计学意义（t=5.275，p=0.000），细胞与时间的交互效应具有统计学意义（t=9.226，p=0.013）。两组细胞6个不同时间肿瘤的生长体积的差异具有统计学意义（t=32.593，p=0.000），随着天数的增加，两组的肿瘤体积相差越大，说明对照组细胞的体内增殖能力强于实验组细胞，并随天数增加差异越大。以上结果均说明ZNF217基因增强后，卵巢癌细胞株在动物体内的成瘤能力受到显著增强，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910和pEGFP-N1/HO-8910两组细胞的体内生长差异从第15d开始，到25d的时候，差异最大，约2.5倍左右。随着天数的增加，两组的肿瘤体积相差越大，说明对照组细胞的体内增殖能力强于实验组细胞，并随天数增加差异越大。以上结果均说明ZNF217基因增强后，卵巢癌细胞株在动物体内的成瘤能力受到显著增强，pEGFP-N1-ZNF217/HO-8910和pEGFP-N1/HO-8910两组细胞的体内生长差异从第15d开始，到25d的时候，差异最大，约2.5倍左右。30天后将裸鼠处死，将皮下成瘤的瘤体剪至1×1×1mm大小，移植到裸鼠的卵巢中，建立原位模型，观察肿瘤成瘤及转移的能力。发现ZNF217基因表达增强后的肿瘤细胞的转移能力明显增强，发现肿瘤转移到腹腔，肠管及肝脏可见转移灶。 3、ZNF217基因与卵巢癌的生存时间相关性及其预后评估： 在44例患者中，其中研究组ZNF217基因阳性的有26人，对照组ZNF217表达阴性的有18人，研究组的平均年龄为47.69±13.73岁，而对照组的平均年龄为48.94±10.06岁，无显著性差异（t=0.330，P=0.436），而妇科临床-病理分期分析中，我们发现，ZNF217阳性晚期患者比ZNF217基因阴性较多，差异具有显著性（t=2.347，P=0.008），说明ZNF217基因表达阳性与临床分期有关，并且与卵巢癌的晚期恶性程度增加有关。而组织分化程度的分析也说明ZNF217基因过表达与组织分化不良有关（P=0.000），患者恶性程度增高，预后不良具有相关性。 结论: 1、ZNF217基因参与了卵巢癌的发生、发展机制； 2、ZNF217基因与卵巢癌患者的病理分级、组织分化、预后以及生存时间密切相关； 3、ZNF217基因是卵巢癌增殖、黏附、侵袭、转移的促进基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前言

技术路线

第一章ZNF217基因真核载体的构建及其表达鉴定

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章ZNF217基因对卵巢浆液性上皮癌细胞生物学特性的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章ZNF217基因与卵巢癌生存时间相关性及其预后评估

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

全文小结

全文讨论

ZNF217基因全长序列

攻读研究生学习期间发表的论文

致谢

统计学核稿证明