ITP新小鼠模型的构建和血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体T、B细胞表位的预测

摘要

目的: 尝试构建新的慢性ITP模型，以便于进行实验研究。从红细胞免疫功能，淋巴细胞免疫功能，细胞因子功能状态等方面，比较不同种属免疫来源的抗血小板抗体构建慢性ITP模型的异同。完成慢性ITP模型构建之后，利用在肿瘤方面日趋成熟的靶位技术，针对ITP的主要靶点-GPⅡb/Ⅲa自身抗体，预测其优势的特异性位点，为ITP新疗法提供候选靶点。 方法: 一、不同种属来源抗血小板血清构建鼠ITP模型的研究。 将小鼠随机分为5组：豚鼠抗血清（GP-APS）组、兔抗血清（R-APS）组、豚鼠正常血清组、兔正常血清组、空白对照组；每组7只小鼠。抗血清组分别于0、1、2、4、6、7d腹腔注射1：32的抗血清（100ul/次）构建小鼠慢性ITP模型；正常血清组在同样时间点注射1：32正常血清；对照组在同样时间点注射等量生理盐水。每组分别于注射后6h、24h、2d、4d、8d、12d、16d进行血细胞计数；观察各组小鼠的一般情况和出血时间；并在各时间点处死小鼠，取血检测IL-2、IFN-r、红细胞C3b受体花环和红细胞免疫复合物花环率及淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+测定，取胸骨髓涂片计数巨核细胞数；取脾脏、胸腺及股骨做病理学检查。 二、血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体T、B细胞表位的预测。 分别应用SYFPEITHI，RANKPEP，BIMAS，SVMHC，PREDEP，MHCPRED，PROPRED软件对人和鼠源的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体蛋白进行HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402限制性表位预测，预测结果各取分值最前的8条用clustalX软件统计表位多肽的重复频率，选择重复次数最多的前6个多肽，三种HLA-I限制性表位共得出18条多肽。去除用HLAPRED软件搜索到不同种属的已发表或能引起自身免疫的多肽片段，将筛选出的HLA-A*0201的序列覆盖HLA-A*1101、HLA-A*2402的序列，进行多肽筛选得出符合条件的CTL表位，再将CTL表位结合predTAP软件和TAPPred软件的“TAP结合预测”，再用NetChop软件、PAProC软件、FragPredict软件的“蛋白酶切位点预测”，筛选出符合3者的共同表位，从而得出最终的CTL表位。Th表位预测用Syfpeithi软件、Rankpep软件、Mhcpred软件、HLAPRED软件进行HLA-DR的Th表位预测，鉴于Syfpeithi、RANKPEP、MHCpred对HLA-DR的预测数目加起来比HLAPRED软件的HLA-DR数目略少，因此把前3种软件数据和HLAPRED数据用clustalX分开统计，结果各取前8条重复次数最多的多肽，共16条多肽，去除已发表的片段，筛选出2者的混合表位。最后取Th表位覆盖CTL表位为最后的CTL、Th混合表位。用DNAstar软件的子程序Protean软件中的Chou-Fasman和Garnier-Robson方案及EXPASY服务器中SOPMA，GOR，HNN软件对两条蛋白链进行二级结构预测；进行可塑性、亲水性和抗原性指数（AI）分析，亲水性分析采用Protean软件的Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案，预测柔韧性及表面可能性采用Karplus-Schultz和Emini方案，AI分析采用Jameson-Wolf法预测潜在的B细胞抗原表位，最后，综合以上七种方案，取其共同重叠的部位为B细胞最佳拟定表位。 结果: 一、不同种属来源抗血小板血清构建鼠ITP模型的研究。 出血时间：兔、豚鼠抗血清组之间出血时间比较无显著差异（P=1．000）；兔、豚鼠抗血清组分别和空白对照组相比均具显著差异（P=0．011，P=0．003），外周血细胞计数：兔、豚鼠抗血清组之间血小板计数比较无显著性差异（P=1．000）。各组红细胞数目变化不大；兔、豚鼠抗血清组血小板计数分别和空白对照组相比均具显著意义（P<0．045，P=0．047）。注射APS6h后，兔抗血清组血小板降至原水平48%，豚鼠抗血清组血小板降至原水平57%，正常血清组升高至原水平的120%；反复注射APS使血小板在9d内维持原水平40%-60%。淋巴细胞亚群：兔、豚鼠抗血清组在CD3+，CD4+间的比较均具显著性意义，说明这2种抗血清引起的CD3+，CD4+变化不同；兔抗血清组在CD4+与正常空白对照组相比均有显著意义（P=0．027），豚鼠抗血清组在CD4+与正常空白对照组相比变化不显著（P=1．000）；而豚鼠抗血清组与正常空白对照组在CD8+差异显著（P=0．034），而兔抗血清组则变化不显著（P=0．328）；兔抗血清组与正常空白对照组在CD4+/CD8+差异显著（P=0．024），而豚鼠抗血清组则变化不显著（P=0．057）。红细胞免疫功能：兔、豚鼠抗血清组之间的C3b受体花环率和红细胞免疫复合物花环比较无显著意义（P=1．000，P=0．831）。IL-2，IFN-r变化：兔抗血清组引起的IL-2变化和豚鼠抗血清组相比具显著的差异（P=0．016），但引起的IFN-r变化无显著意义（P=0．868）；兔抗血清组IL-2、IFN-r分别与正常空白对照组相比均具显著意义（P=0．049，P=0．001）；豚鼠抗血清组IL-2、IFN-r分别与正常空白对照组相比均具显著意义（P=0．000，P=0．001）。骨髓象及组织病理学变化：骨髓巨核细胞数在注射抗血清6h后可见增高，第8d最多，成熟巨核和小巨核约1：1；6h后脾已出现淤血，24h后脾巨核开始增多；4d出现大量巨核细胞，而且淤血严重，8d后脾中可见大量小巨核细胞，成熟巨核细胞极少，第16d脾巨核细胞较仍较多。注射抗血清第8d可见胸腺胸腺萎缩，皮髓质界限不清，第12d已整个萎缩，皮髓质结构整个消失，可见大量小淋巴细胞。第16d胸腺开始恢复。抗血清组与正常空白对照组骨髓巨核细胞数相比具显著差异（P<0．05）。 二、血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体T、B细胞表位的预测。 用SYFPEITHI，RANKPEP，BIMAS，SVMHC，PREDEP，MHCPRED，PROPRED软件预测结果，经去除用HLAPRED软件搜寻已发表的能引起自身免疫的多肽：人源的8条多肽，得出符合条件的人源抗体CTL表位有8条，鼠源有10条。TAP结合预测用clustalX软件选取重复2次及以上的多肽，结果显示人源存在7条多肽，鼠源存在11条；蛋白酶切位点预测采用NetChop、FragPredict、PAProC三种软件的预测结果都包含的位点，结果显示人源存在8个符合的位点，鼠源存在9个；综合TAP结合预测和蛋白酶切位点预测，以CTL预测位点包含TAP结合位点和蛋白酶切位点为筛选要点进行修正，最终的CTL预测结果：人源7条多肽符合，鼠源8条。Th表位预测应用Syfpeithi、RANKPEP、Mhcpred、HLAPRED软件预测，结果显示人源抗体蛋白有6条多肽符合条件，鼠源为8条。最后以Th表位覆盖CTL表位为筛选要点进行表位筛选，得出最终的人源和鼠源各5条CTL、Th混合表位多肽。 SOPMA、GOR、HNN软件预测结果重合的部分：人源有8条多肽重合，鼠源有9条。Protean软件的Chou-Fasman和Garnier-Robson法重叠的区域为：人源为8条多肽，鼠源7条；综合SOPMA、GOR、HNN软件和Protean软件的Chou-Fasman和Garnier-Robson法的预测结果，发现其大部分重合：人源8条多肽重合，鼠源则7条。Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案的亲水性分析显示，两种预测有一定程度的重合：人源有6条、鼠源有5条。Karplus-Schultz和Emini方案预测蛋白柔韧性及表面可能性分析，其重叠区：人源6条，鼠源7条。Jameson-Wolf方案计算得出入源有8条符合的蛋白肽，鼠源有9条。结合上述二级结构等几种方案最终可以得出B细胞优势表位在：Anti-GPⅡb/Ⅲa-Human：5-9，22-30，40-46，55-71，80-90，100-105，110-115。这个结果和T细胞表位比较起来也有部分重叠，可能是T、B细胞混合表位，其混合表位在：1-15，22-38，55-71，109-115。Anti-GPⅡb/Ⅲa-Mice：5-10，38-43，58-70，77-84，99-105。这个结果和T细胞表位重叠部分较少，其可能T、B细胞混合表位是：1-15，68-84，93-107。 结论: 本实验采用鼠血小板免疫兔和豚鼠制备的抗血小板血清，成功构建了鼠慢性ITP模型，并发现模型鼠T淋巴细胞比例失调、红细胞免疫功能紊乱、IL-2、IFN-r水平升高，这些免疫紊乱可能与ITP的发病密切相关。两种抗血清构建的鼠慢性ITP模型，其免疫功能紊乱不尽相同，虽均以CD4+/CD8+升高为主，但CD4+在兔抗血清构建的鼠慢性ITP模型是增多的，而在豚鼠抗血清构建的鼠慢性ITP模型则是下降的。豚鼠抗血清建立的模型在CD4+变化上较兔抗血清建立的模型更接近ITP的发病机制，豚鼠抗血清组在持续时间上优于兔抗血清组。本研究还采用多种软件的多参数分析，成功预测了人源和鼠源GPⅡb/Ⅲa抗体的T、B细胞表位，用于制备特异性抗体，可做为ITP治疗靶标，为进一步研究ITP治疗性疫苗作出初步理论指导。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章构建ITP新小鼠模型的研究

前言

1实验材料与实验方法

2实验结果

3讨论

4小结

参考文献

第二章血小板膜蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体T、B细胞表位的预测

前言

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

参考文献

综述：免疫性血小板减少性紫癜动物模型的研究进展

在读期间发表的论文

致谢

统计学证明