BNIP3-AIF/Endo G通路介导氧葡萄糖剥夺诱导的海马神经元死亡

摘要

脑血管病发病率高，严重危害人类健康。脑中风是目前最常见的危及人类生命的神经系统疾病，是当今第三大死亡原因及首位致残原因。脑缺血损伤所致的神经元大量死亡是导致中风后神经功能丧失的主要原因，而目前仍未阐明缺血性脑损伤的机制，临床上也缺乏有效的治疗手段。因此，研究缺血性神经元死亡机制，探索新的治疗靶点将具有重要意义. 大量证据表明，多种机制参与了缺血性神经细胞死亡，其中包括坏死、凋亡。坏死是一种非程序性快速死亡，而神经元凋亡则是一种高度调节的程序性死亡，过程较慢，并且该死亡过程是可以通过治疗干预来逆转的。典型性神经元凋亡是通过激活caspases，造成细胞核和胞浆底物的降解及细胞的分解。除此之外，中风后的脑组织中仍广泛存在另外一种具有不同生化特点的神经细胞死亡形式，这种细胞死亡也是程序性死亡，但不依赖于caspase的激活，称为非典型性凋亡。国际上对脑缺血激活的caspase依赖性神经元凋亡通路进行了大量而深入的研究，对其分子机理已有了比较明确的认识，然而，目前对非典型性凋亡的分子调节机制尚不明确。 Bcl-2家族众多成员参与了细胞损伤过程。其中BNIP3（Bcl-2/E1B-19K相互作用蛋白3）是一种对缺氧最敏感的Bcl-2促凋亡蛋白。Bcl-2家族大多成员均含有为其线粒体定位及诱导细胞死亡所需的BH3结构域和C末端跨膜结构域。BNIP3也含有BH3结构域，但该结构域既不是BNIP3与其他Bcl-2家族成员形成异二聚体所必须的，也不是BNIP3诱导细胞死亡所必需的，这表明BNIP3不同于其他Bcl-2家族蛋白。研究进一步表明，BNIP3诱导细胞死亡的特点是早期质膜通透性增加，线粒体损伤，但不伴随caspase的激活及细胞色素c的释放。虽然目前对caspase依赖性细胞死亡通路的机理已有了比较明确的认识，然而，对非典型性凋亡的特点及其分子调节机制尚不明了。由于BNIP3对缺氧的敏感性以及其诱导非典型性凋亡的特点，我们研究了其在缺血性神经元死亡中的作用及其下游机制。 首先我们用体外培养海马神经元氧葡萄糖剥夺（OGD）/复氧（R）模型模拟脑缺血来观察OGD/R过程中BNIP3的变化。取培养12天生长良好的海马神经元分成三组：control组，不进行任何处理；EBSS组，将Neurobasal培养基换成EBSS平衡液，正常孵育4h后再换回Neurobasal培养基孵育24 h，设计此组的目的是为了排除由于换液操作引起的细胞损伤；OGD/R组：将Neurobasal培养基换成无糖EBSS平衡液，缺氧孵箱中（1%O2）孵育4 h后再换回Neurobasal培养基正常孵育24 h。结果显示：control组和EBSS组细胞死亡率分别为10.65±2.69%和10.16±2.94%（p>0.05），而OGD/R组细胞死亡率达到37.71±6.80%（p<0.01）。并且control组和EBSS组细胞活性百分率分别为100.00±6.96%和96.31±6.91%（p>0.05），而OGD/R组则降至46.94±7.02%（p<0.01）。可见OGD（4h）/R（24 h）引起明显的细胞损伤。那么在OGD/R过程中BNIP3表达是否发生变化以及是如何变化的，我们又分别观察了复氧后0h，2h，6h，12 h，24 h各个时间点BNIP3的表达，全细胞Western Blot结果显示：20 KD BNIP3（前体蛋白形式）在OGD/R0h即升高至对照组的2.36±0.33倍，（p<0.01）：30 KD（单体形式）和60 KD（二聚体形式）的BNIP3在OGD/R2 h分别升高至对照组的3.50±0.46倍和1.84±0.31倍，（p<0.01），三种形式的BNIP3均随着复氧时间的延长而增加，并在OGD/R12 h达到最高值。因为BNIP3主要是通过形成同二聚体插入到线粒体上发挥其促凋亡功能，我们又进一步观察了亚细胞器线粒体上BNIP3的变化。结果显示：20 KD和60 KD的BNIP3在复氧后0h即升高至对照组的2.14±0.23倍和3.42±0.31倍（p<0.01），并随复氧时间的延长增加，在OGD/R24 h达到最高。而30 KD的BNIP3在线粒体上基本观察不到。为了验证升高的BNIP3是否参与细胞损伤，我们观察过表达BNIP3对细胞死亡的影响。结果显示：对照组细胞死亡率为22.86±6.82%，而过表达BNIP3可引起细胞死亡率升高至62.46±9.62%（p<0.01），表明过表达BNIP3可引起细胞损伤。并且抑制BNIP3可以使OGD/R12 h后的细胞死亡率由对照组的32.87±1.80%降至18.07±1.46%（p<0.01）及OGD/R24 h后的细胞死亡率由37.25±2.15%降至16.02±1.21%（p<0.01）。以上实验均证明BNIP3参与了OGD/R诱导的细胞死亡。 BNIP3介导caspase非依赖性细胞凋亡途径的下游机制尚不明确。研究表明，Endo G（核酸内切酶G）和AIF（凋亡诱导因子）作为线粒体功能障碍的下游分子，同样参与了caspase非依赖性细胞死亡通路。Endo G和AIF都是线粒体蛋白。Endo G是一种线粒体DNA酶，当其从线粒体释放出来之后，可以转位到细胞核，并且以caspase非依赖性方式将染色质DNA剪切为核小体碎片。AIF是一种含氧化还原酶结构域的线粒体黄素蛋白，当其从线粒体释放出来后可与Endo G结合，共同促进DNA降解及细胞凋亡。这是目前确定的唯一不依赖caspase活性的DNA降解通路。我们研究了Endo G和AIF是否作为BNIP3的下游分子介导OGD/R诱导的细胞凋亡。 首先，我们观察了OGD/R过程中AIF和Endo G的变化。全细胞Western Blot结果显示：AIF和Endo G在OGD/R6 h分别升高至对照组的1.84±0.18倍和1.54±0.18倍，（p<0.01）。随复氧时间的延长表达上调，并在OGD/R12 h最高。以往实验证明AIF和Endo G在细胞受到损伤后由线粒体释放转位到核上发挥促凋亡功能，我们又进一步分别观察OGD/R后AIF和Endo G的核转位。结果显示：线粒体AIF和Endo G在OGD/R2 h表达分别降至对照组0.63±0.12倍和0.58±0.80倍，（p<0.01），并随复氧时间的延长增加，在OGD/R24 h降至最低；而相应核中AIF和Endo G在OGD/R2 h表达分别升高至对照组的1.60±0.11倍和3.62±0.41倍（p<0.01），在OGD/R12 h最高。说明OGD/R过程中AIF和Endo G可能由线粒体转位到核。为进一步研究AIF/Endo G核转位和细胞死亡之间的关系，我们分别观察了OGD/R后各个时间点的核转位率和细胞死亡率，结果证明OGD/R12 h细胞死亡率具有显著性差异，而AIF和Endo G的核转位在OGD/R2h即呈现显著性差异，提前于细胞死亡之前，表明AIF和Endo G核转位发生在细胞死亡之前，提示AIF和EndoG核转位可能是细胞损伤的诱导因素而不是伴随现象。 其次，为研究BNIP3和AIF/Endo G核转位的关系，我们过表达BNIP3来观察对AIF/Endo G核转位的影响。结果显示：过表达BNIP3可以引起核AIF转位由对照组的30.44±5.57%升高到70.12±7.51%（p<0.01）；核Endo G转位由25.92±3.99%升高到60.01±8.51%（p<0.01）。可见过表达BNIP3可以诱导AIF和Endo G发生核转位。并且抑制BNIP3表达也得出一致的结论，抑制BNIP3表达可以使OGD/R2 h后AIF核转位由24.58±3.39%降低到12.5±3.66%（p<0.01），使OGD/R6 h由51.67±5.60%降低到29.29±6.74%（p<0.01）。以上实验均证明AIF/Endo G可能是BNIP3的下游分子。 再次，我们在来源于Harlequin（Hq）C57小鼠的海马神经元上再次对AIF是否是BNIP3的下游分子进行验证。这种小鼠AIF表达降低大约80%。过表达BNIP3可以引起野生型C57海马神经元死亡率由对照组的2.13±5.32%升高到58.86±6.50%，但仅引起Hq C57海马神经元死亡由对照组的23.25±4.95%升高到35.38±6.19%，升高的幅度有了明显降低（p<0.01）。可见下调AIF降低过表达BNIP3引起的细胞死亡，进一步证明AIF是BNIP3的下游分子。并且AIF下调并不影响BNIP3的表达，OGD（4 h）/R（24 h）后仍可见BNIP3表达升高。OGD/R不能诱导Hq C57海马神经元出现显著性死亡，表明在OGD/R中AIF是一个重要的下游分子。 综上所述，OGD/R引起BNIP3表达升高并插入到线粒体上，继而诱导AIF和Endo G由线粒体释放，转位到细胞核引起细胞损伤。

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参考文献

Review The effect of BNIP3 in cell death

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