补体C5a受体在单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中的表达

摘要

研究显示肾间质病变与慢性肾功能衰竭的进展关系密切，肾间质纤维化几乎是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础。研究其病理过程和发生机制，寻找延缓和阻断肾间质纤维化新靶标，是目前国内外肾脏病研究的热点方向。 肾间质纤维化的病理过程主要是肾小管．间质损伤，炎症细胞侵入，促进纤维化的因子包括转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、血小板源性生长因子（PDGF）等生成增加，抑制纤维化的因子例如：肝细胞生长因子（HGF）和核心蛋白多糖（Decorin）等生成减少；还有肌成纤维细胞形成和增值，细胞外基质（ECM）积聚的过程。在众多促纤维化的因子中，TGF-β1被认为是最重要的促纤维化因子。很多研究试图通过抑制TGF-β1阻止肾纤维化进展。然而，要将其研究应用于临床尚有很多问题需要解决，例如，目前的方法还很难在人体肾脏产生显著的反义抑制TGF-β1表达的寡义核苷酸来抑制TGF-β1的表达。其次TGF-β1也是一个抗炎细胞因子，长期抑制TGF-β1会诱发炎症，研究发现TGF-β1基因敲除的小鼠可死于多发性炎症。 因此迫切需要寻找防治肾间质纤维化的更好靶点，在抗纤维化的同时不影响机体的正常生理功能。 补体C5是新近发现的致纤维化因子，参与肝、肺等多种器官的纤维化进展，最近研究发现在肾纤维化的进展发挥作用。 Peter Boor等发现在单侧输尿管梗阻（UUO）诱导的小鼠急性肾间质纤维化模型中，C5基因敲除（应用基因敲除技术敲除某些特定基因使C5不表达）小鼠组的肾纤维化程度显著低于正常小鼠组，尤其在梗阻早期（第5天到第10天）C5基因敲除小鼠组在Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白、平滑肌肌动蛋白、波形蛋白等纤维化指标上与野生正常小鼠组相比显著降低。由此认为在肾脏疾病中C5作为新发现的促纤维化因子，有可能成为预防和治疗肾纤维化的潜在靶标。 补体C5a受体（C5aR）是补体系统中的一重要分子，主要表达在髓系来源的细胞的细胞膜上，通过与C5a（补体C5的裂解片段）的结合发挥作用。最近研究发现其在正常人肾脏的近曲小管上皮细胞也有表达，并且参与肾间质损伤的过程。在蛋白尿肾纤维化实验动物模型中肾小球滤过的和肾脏局部产生的补体蛋白在肾脏近曲小管活化后与局部的补体受体结合产生趋化粒细胞因子，趋化巨噬细胞等粒细胞向炎症处游离，而巨噬细胞诱导多种细胞因子的释放等，促进肾损伤的进程。但是关于C5aR在非蛋白尿的肾损伤实验动物模型中的作用及其机制，目前国内尚未见到此方面的报道。Peter Boor首次报道补体C5基因敲除小鼠在单侧输尿管梗阻引起的肾纤维化模型中，肾纤维化程度明显减轻。而UUO模型是非蛋白尿的肾损伤实验动物模型，在UUO模型中C5aR发挥作用的机制是否与其在蛋白尿肾损伤实验动物模型中一样，是否有其他机制在U UO模型肾损伤中发挥作用，还不是很清楚。补体C5的作用主要是由C5a（C5的裂解片段，具有活性）与C5aR结合介导，C5aR是否在UUO诱导的肾间质纤维化模型中是否介导补体C5的致纤维化作用，尚不清楚。 补体系统在肾脏疾病中扮演损伤和保护两种角色，Stefan P．Berger等通过基因敲除的肾炎动物模型的研究发现补体活化的上游成分对机体有有益作用：比如调理作用和清除体内免疫复合物和细胞凋亡等；而下游成分比如C5，则起有害作用。C5抑制剂可以阻断肾小球肾炎的进展，抑制补体下游成分C5和膜攻复合物（MAC）的产生，而保留上游成分对机体的保护作用。如果我们通过应用C5抑制剂或者C5aR受体阻滞剂可以阻断补体C5在肾纤维化中的作用，达到延缓肾纤维化进程，减轻肾纤维化程度，而同时不影响其抗炎作用，这对防治肾纤维化将起到积极作用。 UUO模型诱导的小鼠肾小管间质纤维化，是公认的用于研究急性肾间质纤维化的经典模型，可以迅速达到实验的要求且无蛋白尿，广泛应用于肾间质纤维化的研究。 我们通过结扎单（左）侧输尿管，引起输尿管急性梗阻，诱导急性肾间质纤维化模型来研究C5aR和TGF-β1在肾间质纤维化中组织中的表达，探讨C5aR和TGF-β1在肾间质纤维化中相关关系及可能的作用机制，为临床防治肾纤维化提供新思路，也为进一步解释肾间质纤维化的发生发展机制提供有益参考。 研究目的: 1、动态观测单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中C5aR和TGF-β1的表达变化，探讨C5aR和TGF-β1在肾纤维化进程中的相关关系； 2、探讨C5aR在肾小管间质纤维化发展中的作用机制。 研究方法: 1、造单侧输尿管梗阻模型 将36只雄性SD大鼠随机分为UUO组及假手术组（SOR）组，UUO组行左侧输尿管结扎术，SOR组仅游离左侧输尿管不结扎。分别于术后第5、10、15天处死每组中的6只大鼠，取左肾（梗阻侧）行HE和Masson染色。 2、用免疫组化ELiVisionTMplus法检测肾组织C5aR和TGF-β1的表达。 3、用SPSS13．0对结果进行数据分析，本实验为2×3*6的析因设计，行方差分析了解梗阻和时间两处理因素的单独效应、主效应和交互效应，每个指标的组内、组间比较采用单因数方差分析，多重比较若方差齐采用SNK或LSD法，不齐采用DunnettT3或Dunnett C检验，C5aR、TGF-β1免疫组化阳性程度与肾纤维化程度百分比、肾小管间质损伤指数的相关分析采用Spearmen相关系数法分析和偏相关系数法分析C5aR免疫组化阳性程度与肾纤维化程度百分比、肾小管间质损伤指数的相关关系，当P<0．05时，差异有统计学意义。 结果: 1、HE、MASSON染色评估肾纤维化程度 结果模型组第5天远端小管扩张，肾间质轻度水肿，间质内有炎细胞浸润；梗阻第10天近端小管扩张，部分小管上皮细胞变性坏死；第15天可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩，胶原增多，纤维化明显，随着梗阻时间延长，肾间质纤维化程度不断进展，肾小管损伤指数不断升高，且不同时间点差异有显著统计学意义（P<0．05）。 2、免疫组化结果显示 C5aR和TGF-β1在假手术组大鼠肾组织中仅有少量表达。模型组大鼠梗阻侧肾组织中C5aR和TGF-β1表达随着肾纤维化程度进展而表达明显增多与假手术组不同时间点相比差异有统计学意义（P<0．05），而C5aR在梗阻晚期（第10-15天）增多并不明显，梗阻第10天和梗阻第15天相比差异无统计学意义。 结论: C5aR除了在肾间质和远曲小管有表达外，在集合管上皮细胞、肾小球系膜细胞均有表达，C5aR免疫组化阳性强度同肾间质损伤指数、肾间质纤维化程度显著正相关，控制TGF-β1后行偏相关分析仍呈正相关，且随着梗阻时间的延长表达逐渐增多，提示其可能通过一条与TGF-β1的信号通路相平行的通路独立发挥作用，介导补体C5在肾纤维化中的作用；TGF-β1主要在肾脏近曲小管、远曲小管、集合管上皮细胞和小球系膜细胞表达，且以细胞胞浆表达为主，在SOR组表达微弱，在UUO组随着梗阻时间延长，免疫组化阳性强度逐渐增强，TGF-β1是致肾纤维化的主要因子，在肾纤维化进展中发挥重要作用，通过本实验我们不能排除C5aR也可能作为TGF-β1的上游信号因子在肾间质纤维化早期通过上调TGF-β1发挥致纤维化作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章 材料与方法

一、研究对象

二、主要仪器

三、主要试刑

四、实验方法

五、统计学处理

第二章 实验结果

一、造模结果

二、TGF-β1的免疫组化

三、C5aR的免疫组化结果

四、C5aR和TGF-β1免疫组化阳性强度与肾纤维化程度、肾小管损伤指数的相关性分析结果

第三章 讨论

一、补体C5与C5aR的相关研究

二、UUO模型的建立

三、C5aR在UUO模型肾组织的表达

四、TGF-β1及其在UUO模型肾组织的表达

五、C5aR和TGF-β1相关性的研究

六、实验中存在的不足与缺陷

七、应用前景及展望

第四章 参考文献

第五章 缩略词对照表

第六章 攻读学位期间成果

第七章 致谢