降钙素基因相关肽对糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖和表型转化的影响的研究

摘要

研究背景：
　　 勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是常见的泌尿男科疾病,流行病学调查显示当前全球约有1.52亿男性正遭受到ED的困扰,特别是45岁以上的男性患ED的风险性明显增高,预计到2025年全世界将有3.22亿男性会经历ED。而糖尿病与ED的发生关系密切,糖尿病已被公认为ED最重要的危险因子之一,ED更是糖尿病常见的并发症。WHO的报告指出,有50％～75％的糖尿病病人患有不同程度的勃起功能障碍,糖尿病病人ED的发生率比正常人高3倍。
　　 糖尿病导致ED的发病机制是多方面的,其中血管因素在糖尿病性ED形成过程中起着很重要的作用。阴茎海绵体具有血窦结构,与血管系统具有很多相似性,因此被认为是一种特殊的血管类组织。阴茎海绵体平滑肌是海绵窦间隙舒张及阴茎勃起的结构基础,在正常阴茎勃起的血流动力学变化中,发挥着关键作用。
　　 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)根据结构和功能的不同分为收缩型(分化型)和合成型(去分化型)两种类型,收缩型的功能是收缩,而合成型的主要功能是增生、迁移、分泌及降解胞外蛋白等。当血管受到损伤或体外培养的VSMC受到生长因子刺激时,VSMC可从分化型转化为去分化型并获得增殖能力,这个形态、结构和功能的改变过程称为表型转化。在动脉粥样硬化形成过程中VSMC的增殖、迁移是重要的病理变化,由VSMC表型转化所引发的血管重构是血管再狭窄和动脉粥样硬化等血管病变发生发展的基础。鉴于阴茎海绵体的血窦结构与血管系统具有很多相似性,我们在前期研究中已初步证实了糖尿病、高血压等疾病所致的ED动物模型的阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth muscle cells,CCSM)也有表型转化现象的存在,并与勃起功能障碍相关。
　　 因此,从平滑肌细胞异常增殖和表型转化的角度出发,探索影响CCSM增殖和表型转化的相关因子就成为研究ED发病机制和治疗手段的一个新思路。降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一种生物活性多肽,广泛分布于中枢和外周神经系统及心血管系统,具有强大的扩张周围血管、降低血压、保护缺血心肌和抑制平滑肌细胞增殖等作用,特别是近年研究发现CGRP对心血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用,并同时可使血管平滑肌细胞从合成型向收缩型转化,即对血管平滑肌细胞表型转化有逆转作用。但CGRP对于与血管平滑肌细胞相类似的CCSM、特别是处于糖尿病状态下的CCSM是否也有抑制其增殖并逆转其表型转化的作用,未见文献报道。
　　 在研究过程中要判断CCSM是否发生表型转化或逆转化,细胞表型标记物的选择相当重要。碱性调宁蛋白(Calponinl,Cnnl),是平滑肌组织特有的调节蛋白,是近几年新发现的一种平滑肌表型特异性标志物,因其仅在收缩型血管平滑肌中高表达,故更具有分化表型特异性。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种分泌型的酸性磷蛋白,与骨形成、吸收,钙调节有关,但也与某些肿瘤发生、VSMC的移行、增殖及钙化相关,被认为是平滑肌细胞合成表型的标志物之一。Cnnl表达的增多或者OPN表达的减少提示平滑肌细胞由合成型向收缩型转化。
　　 本课题研究立足于上述基础,首先建立糖尿病性勃起功能障碍大鼠CCSM体外培养模型,将CGRP作用于体外细胞模型,比较作用前后各组CCSM的增殖变化情况以及表型标记物Cnnl mRNA和OPN mRNA的表达量的变化情况,进而评估CGRP对糖尿病性ED大鼠CCSM的增殖及表型转化的影响。
　　 目的：
　　 通过建立糖尿病性勃起功能障碍大鼠CCSM体外培养模型,了解糖尿病性ED大鼠CCSM的生物学特点:将CGRP作用于该体外细胞模型,通过检测细胞增殖量的变化及平滑肌细胞表型标记物表达量的变化情况来了解CGRP对糖尿病性ED大鼠CCSM的增殖及表型转化的影响,尝试从表型转化这一新角度来认识糖尿病性ED的发病机制,并期待发掘出一条治疗ED的新途径。
　　 方法
　　 1.15只雄性SPF级8周龄SD大鼠随机分为两组:(1)糖尿病组:10只,腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)；(2)正常对照组:5只,仅注射柠檬酸.柠檬酸钠缓冲液。分别于72h、1w、2w后采用割尾法采血测血糖,以随机血糖水平>16.7 mmol/L,为糖尿病动物建模成功标准。取建模成功的糖尿病大鼠,继续饲养至8w后,在颈项皮肤松弛处行皮下注射阿朴吗啡(Apomorphine,APO)100μg/kg,根据勃起情况筛选出ED模型。建模成功组和正常对照组大鼠处死后取阴茎海绵体组织,采用改良组织块贴壁法分别进行CCSM体外培养,观察并比较两组细胞生长情况及形态特点。CCSM的鉴定采用平滑肌a-肌动蛋白(a-SM-Actin)、结蛋白(desmin)免疫组织化学法。
　　 2.上述体外培养的糖尿病性ED大鼠CCSM,取传代的第2代细胞用于本实验,以传代的第2代正常大鼠CCSM作为对照。随机分为4组:A正常细胞CGRP作用组,B正常细胞无CGRP作用组,C糖尿病性细胞CGRP作用组,D糖尿病性细胞无CGRP作用组。CGRP作用的终浓度分为lnmol/L、10nmol/L、100nmol/L三组,用PBS缓冲液作为阴性对照试剂。用MTT法检测各组细胞增殖情况,结果以OD值表示,绘制各组细胞生长曲线,并计算细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率(％)=(OD对照-ODcGRP)/OD对照×100％。
　　 3.分组同上,CGRP作用的终浓度为100nmol/L,经CGRP作用24h后,用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测各组表型标记物Cnnl mRNA和OPNmRNA的表达量。
　　 结果
　　 1.糖尿病性ED大鼠造模成功,用改良组织块法培养糖尿病性ED大鼠CCSM,3d后可见细胞游出,16～18d细胞长成单层,均快于正常大鼠CCSM(t=3.813,P=0.007；t=7.721,P=0.000),传代后细胞增殖旺盛,呈“峰一谷”样生长。培养的细胞经a-SM-Actin和desmin免疫组化染色鉴定为平滑肌细胞。
　　 2.不同浓度CGRP作用组在三个时间点(24h、48h、72h)所测得的OD值均显著低于空白对照组(P<0.05),即不同浓度的CGRP对CCSM的增殖均有抑制作用。
　　 糖尿病性CCSM组与正常CCSM组间细胞增殖抑制率比较,除24h时两组间无显著性差异外,于48h、72h时在不同浓度CGRP作用下两组间抑制率均差异显著(P<0.05),CGRP对糖尿病性CCSM增殖的抑制作用较正常CCSM更显著。
　　 不同浓度CGRP对糖尿病性CCSM抑制率比较结果,24h时三个浓度间均无显著差异,48h、72h时,lnmol/L组和10nmol/L组间无显著差异,但100nmol/L组抑制率明显高于其余两组(F=12.930,P=0.001:F=20.216,P=0.000),提示达到一定浓度水平后随着CGRP浓度增加而抑制程度升高。
　　 3.正常CCSM组经CGRP作用后,CGRP作用组与无作用组间的CnnlmRNA和OPN mRNA表达水平差异不显著；糖尿病性CCSM组经CGRP作用后,CGRP作用组相较于无作用组Cnnl mRNA表达显著上调(P=0.000),OPNmRNA表达水平显著减少(P<0.05)。提示经CGRP作用后可使糖尿病性CCSM表型从合成型向收缩型转化。
　　 结论
　　 1.改良组织块贴壁法建立糖尿病ED大鼠CCSM体外培养模型简便、稳定；糖尿病ED大鼠CCSM较正常CCSM增殖速度快,在光镜下形态与正常CCSM差别不显著。
　　 2.不同浓度的CGRP对糖尿病性CCSM的增殖均有抑制作用,抑制程度随CGRP浓度增加而升高；并且CGRP对糖尿病性CCSM增殖的抑制作用较正常CCSM更显著。
　　 3.CGRP可使糖尿病性CCSM的Cnnl mRNA表达显著上调,OPN mRNA表达水平显著减少,说明CGRP可使糖尿病性CCSM从合成型向收缩型转化,对其表型转化有逆转作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养模型的建立

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 附图

第二章 降钙素基因相关肽对糖尿病性阴茎海绵体平滑肌细胞增殖和表型转化的影响

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三节 实验结果

第四节 附图

第三章 讨论

第四章 全文小结

第五章 参考文献

第六章 综述

参考文献

缩略词表

读硕士学位期间成果

致谢

统计学证明