脑缺血后海马CA1区caspase非依赖性凋亡相关蛋白表达水平的改变以及亚细胞定位

摘要

脑血管病发病率高,严重危害人类健康。脑中风是目前最常见的危及人类生命的神经系统疾病,是当今第二大死亡因为及首位致残因为。脑缺血损伤所致的神经元大量死亡是导致中风后神经功能丧失的主要因为,而目前仍未阐明缺血性脑损伤的机制,临床上也缺乏有效的治疗手段。因此,研究缺血性神经元死亡机制,探索新的治疗靶点将具有重要意义。
　　 脑中风可引起缺血中心区(缺血坏死区)神经元的急性损伤,以及缺血半暗区(缺血坏死区周围有一较病灶中心密度稍低的区域,称病灶周围区或半暗区)神经元的继发性损伤,即迟发件神经元死亡。迟发性神经元死亡的发生机制主要为凋亡,凋亡是一种高度调节的程序件细胞死亡过程,以往的研究表明,caspase(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)依赖性机制在这一过程中起重要作用,但最近有越来越多的研究表明casepase非依赖性机制也参与了迟发性神经元死亡。虽然目前对caspase非依赖性细胞凋亡的调节机制尚不明确,但已经发现了一些与caspase非依赖性细胞凋亡相关的分子,如Bcl-2与腺病毒E1B-19K相互作用蛋白3(BNIP3),凋亡诱导因了(AIF),核酸内切酶G(EndoG)等。我们实验室的前期工作已经发现,在原代培养的海马神经元氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)模型中,BNIP3的表达升高并且插入到线粒体上,继而诱导线粒体内的AIF由线粒体释放,转位到细胞核引起细胞损伤。但BNIP3是否参与大鼠伞脑缺血/再灌注损伤中海马神经元的死亡以及是否发生AIF的核转位目前还不清楚。
　　 BNIP3是一种促凋亡蛋白,属于Bcl-2家族促细胞凋亡亚家族中的BH3-only亚家族,研究表明BNIP3参与了包括上皮细胞,心肌细胞,神经胶质细胞,神经元等多种细胞的死亡过程。Bcl-2家族众多成员参与了细胞损伤过程。其中BNIP3是BH3-Only亚家族中对缺氧最敏感的促凋亡蛋白。Bcl-2家族大多数促凋亡成员均含有为其线粒体定位及诱导细胞死亡所需的BH3结构域和C末端跨膜结构域。BNIP3也含有BH3结构域,但该结构域既不是BNIP3与其他Bcl-2家族成员形成异二聚体所必须的,也不是BNIP3诱导细胞死亡所必需的,这表明BNIP3不同于其他Bcl-2家族蛋白。研究进一步表明,内源性BNIP3与线粒体疏松结合,当受到凋亡信号刺激时,BNIP3靠它的跨膜结构域插入线粒体外膜,引起线粒体通透性转换孔(permeability transition pores,PTP)开放,线粒体膜内外电化学梯度降低,氧自由基产生增多,线粒体功能失调,进而导致细胞死亡。BNIP3介导的细胞死亡不依赖于细胞色素C的释放以及Apaf-1,caspase的激活,以早期质膜以及线粒体膜损伤为特点。但BNIP3是否参与大鼠伞脑缺血/再灌注损伤中海马神经元的死亡以及引起细胞死亡的机制目前还不清楚。
　　 目前对于:BNIP3引起细胞死亡的下游分子机制还未明确。AIF是已知的线粒体功能障碍的下游分子之一,参与了caspase非依赖性细胞死亡通路。AIF是存在于线粒体内外膜之间的凋亡相关蛋白。当细胞受到特定的凋亡诱导信号的刺激后,线粒体膜上的PTP打开,允许它们从线粒体释放到胞浆,并转位到核内进而引起DNA的大片段裂解,但AIF本身没有核酶的特性,它的DNA降解作用是通过其它核酶来实现的。EndoG很可能是AIF的相互作用分子。AIF和EndoG参与多种细胞的死亡通路,但其是否是BNIP3诱导细胞死亡的下游分了目前尚不明确。
　　 本研究观察了脑缺血/再灌注后大鼠海马神经元的死亡情况。采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法制做大鼠全脑缺血再灌注模型,通过尼氏染色观察海马神经元的存活状况,与假手术组相比,缺血后7天的海马CA1区有大量神经细胞皱缩,胞核碎裂消失,结构不清,证明我们的模型确实引起海马神经元的死亡。
　　 首先,通过Western Blot观察了BNIP3在脑缺血/再灌住后不同时间点海马CA1区全细胞以及线粒体中的表达清况。在缺血/再灌注后不同时间点,假手术组于术后24小时麻醉大鼠,断头取脑,分离海马CA1区,提取全细胞及线粒体蛋白样品。全细胞样品的结果显示BNIP3单体(20KD)于缺血/再灌注后增加,差别有统计学意义(F=33.117,P=0.000)；缺血/再灌注后6,12,24,48小时组BNIP3单体(20KD)蛋白的表达水平分别是假手术组的1.51±0.10,1.804±0.14,2.14±0.11,2.46±0.23倍,差别有统计学意义(P<0.05)；BNIP3双聚体(60KD)在缺血/再灌注后表达水平上调,差别有统计学意义(F=23.113,P=0.000)。缺血/再灌注后6,12小时组BNIP3双聚体(60KD)蛋白的表达水平分别是假手术组的1.82±0.13,1.86±0.10倍,差别有统计学意义(P<0.05),缺血/再灌注后1,24,48小时组与假手术组比较虽然没有统计学差异,但仍有增高的趋势。在海马CA1区线粒体中没有观察到BNIP3单体的表达,而BNIP3双聚体在缺血/再灌注后表达水平增加,差别有统计学意义(F=30.214,P=0.000)。缺血/再灌注后12,24小时组BNIP3双聚体表达水平分别是假手术组的1.74±0.13,1.54±0.04倍,差别有统计学意义(P<0.05)。BNIP3表达水平的改变提示它可能参与了大鼠脑缺血/再灌注后海马神经元的死亡。
　　 其次,通过Western.Blot观察AIF在脑缺血/再灌沣后不同时间点的大鼠海马CA1区全细胞的表达清况。结果发现缺血/再灌注损伤后AIF表达水平上调,差别有统计学意义(F=2.643,P=0.49)。缺血/再灌注后12,24,48小时组AIF表达水平分别是假手术组的1.77±0.24,1.67±0.20,2.00±0.37倍,差别有统计学意义(P<0.05)。AIF表达水平的改变提示它可能参与了大鼠脑缺血/再灌沣后海马神经元的死亡。
　　 最后,为明确.AIF是否发生了从线粒体到细胞核的转位,我们又进一步研究了海马CA1区线粒体中AIF表达水平的改变。结果发现缺血/再灌注后AIF表达水平下调(F=18.612,P=0.000),表明AIF可能发生了从线粒体的释放,并且从时间上观察AIF由线粒体释放较晚于线粒体BNIP3的上调,提示AIF可能参与了BNIP3介导的海马神经元死亡通路。另一方面,通过Western Blot观察AIF在脑缺血/再灌注后不同时间点的海马CA1区细胞核内的表达清况。结果发现缺血/再灌注后海马CA1区细胞核上AIF蛋白水平上调,差别有统计学意义(F=4.447,P=0.016),提示AIF从线粒体转位到细胞核。为明确AIF是否发生了从线粒体到细胞核的转位,我们又研究了海马CA1区细胞质部分AIF蛋白水平的改变。结果发现缺血/再灌注后海马CA1区细胞质部分AIF蛋白水平下调,差别有统计学意义(F=51.001,P=0.000)。这一结果表明AIF从线粒体释放后没有停留在细胞浆中,进一步支持AIF发生了向细胞核的转位。
　　 综上所述,所得到的这些结果为进一步研究BNIP3诱导的caspase非依赖性细胞死亡的分子机制奠定基础。

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