舒芬太尼预处理对高糖孵育H9c2大鼠成肌细胞缺氧复氧性损伤和凋亡的保护作用及其可能机制

摘要

研究背景：
　　 心肌低灌注、缺血和复流、再灌注缺伤是非心脏手术围术期引起心脏各种危险事件(Cardiac Risk Events CRE)的最常见因为。缺血再灌注损伤是一种比较复杂且广泛的病理生理过程,心脏恢复过程中发生的心肌缺血再灌注损伤会增加心肌原有的损害和心律失常的发生,严重影响缺血后心脏功能的恢复,对围术期病人的生活质量甚至生命造成巨大的威胁。
　　 舒芬太尼是一种非选择性阿片受体激动剂,在阿片类制剂中舒芬太尼的镇痛效应最强,已经广泛应用于临床麻醉及术后、ICU的镇痛。近年来已有部分临床和动物实验研究显示舒芬太尼对缺血再灌注性心肌损害有很好的保护作用,研究主要在于生化指标及大体心肌的梗死面积,其确切保护机制尚不清楚,且对其在离体心肌及心肌细胞凋亡方面的影响研究还未见报导。本研究拟采用舒芬太尼对缺氧复氧前的细胞进行预处理,研究其对高糖浓度及正常糖浓度孵育下H9e2成肌细胞缺氧复氧引起的细胞凋亡及细胞损伤是否具有保护作用及其作用机制。
　　 目的：
　　 ①通过对各种指标的检测评估缺氧复氧过程对H9C2细胞造成的损伤；
　　 ②综合评价舒芬太尼预处理对缺氧复氧损伤后的H9C2细胞有无保护作用；并研究舒芬太尼预处理对细胞缺氧复氧损伤存在影响的机制；
　　 ③综合评价舒芬太尼预处理对高糖孵育下缺氧复氧损伤后的H9C2细胞的保护作用；
　　 ④观察部分指标在正常环境和高糖环境下的异同,探讨高糖培养液对细胞损伤和凋亡的影响。
　　 方法
　　 1.模型制作
　　 采用DMEM含10％FBS细胞培养基培养H9C2心肌细胞株。实验前弃旧培养液,PBS洗2次,然后随机分组。以细胞处于缺氧环境而后进行复氧作为损伤模型,细胞于换液后放入缺氧三气培养箱中进行缺氧3h(缺氧过程),缺氧培养箱参数为5％CO2、氧气浓度小于2％,其余用氮气平衡,缺氧结束后将各组细胞移入37℃CO2培养箱(复氧过程)培养3h后收集标本进行各种指标检测。
　　 2.分组
　　 培养于96孔板或6孔板的细胞随机进行分组。
　　 第一部分分组:
　　 细胞分为正常对照组(NC组)、缺氧复氧损伤对照组(HR组)、舒芬太尼预处理组(SF组)。根据不同浓度舒芬太尼(1×10-11、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mol/L),SF组又分为SF11、SF10、SF9、SF8、SF7、SF6组,每组6孔。
　　 第二部分分组:
　　 包括正常对照组(NC组)、缺氧复氧损伤对照组(HR组)、舒芬太尼预处理组(SF组)、纳洛酮组(NA组),每组为6孔。SF组的培养液中在缺氧前15min加入终浓度为10-9mol/L的舒芬太尼；HR组培养液中加入与SF组舒芬太尼同体积的PBS缓冲液,NA组培养液中含有终浓度为10-9mol/L的舒芬太尼和10-6mol/L的纳洛酮,纳洛酮在舒芬太尼前10min加入培养液中；NC组换入DMEM+10％FBS培养液后继续入培养箱正常培养,标本收集时间同其余各组。
　　 第三部分分组:
　　 包括正常糖组和高糖组。正常糖组包括:正常对照组(NC组)、模型组(HR组)、舒芬太尼预处理组(SF组)、纳洛酮组(NA组)；高糖组包括:高糖对照组(HC组)、高糖模型组(删R组)、高糖舒芬太尼预处理组(HSF组)、高糖纳洛酮组(HNA组)；每组为6孔。
　　 正常环境组细胞处理方法同第二部分分组,高糖各组与对应各正常糖组处理方法相同,区别在于高糖组缺氧复氧之前48小时用高糖DMEM液培养细胞,缺氧复氧前亦换入高糖DMED培养液。
　　 3.实验方法与技术
　　 (1)显微镜下观察细胞状态 细胞培养于6孔板中,实验完成后立即在荧光倒置显微镜下观察并拍照记录细胞状态。
　　 (2)MTT法测细胞活力 细胞计数后以104个/孔接种于96孔板中,培养24h后用于实验,缺氧复氧后每孔加入20μl(5mg/ml)MTT试剂,37℃培养箱继续孵育4h,弃上清加入100μl二甲基亚砜(DMSO),室温摇床30min,酶标仪570nm波长测定OD值。
　　 (3)LDH与SOD检测 收集实验处理后各组6孔板中培养液,按试剂盒说明进行LDH活力检测和计算。SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法,酶消化法收集6孔板中细胞,400μl PBS重悬,超声波破碎细胞,取悬液严格按试剂盒说明进行SOD活力测定和结果计算。
　　 (4)Annexin V-FITC/PI双标记法测定细胞凋亡率 胰酶消化法(不含EDTA)收集实验结束后的细胞及培养液,1000g离心5min,弃上清PBS重悬并计数,取10万重悬细胞1000g离心5min,弃上清,随后按说明书步骤进行。
　　 (5)Western Blot方法实验前考马斯亮蓝法测定蛋白样品浓度,取同相同蛋白量样品上样,12％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,湿转法转印到PVDF膜上,5％脱脂奶粉室温封闭1h,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育1h,ECL显色,曝光于X光胶片,通过蛋白预染Maker确定目的条带。
　　 结果
　　 1.细胞状态的变化
　　 镜下观察到,NC组细胞分界清晰,细胞核轮廓清楚,核仁明显；HR组细胞分界不清,核轮廓模糊,核仁不明显,可见凋亡小体。视野中大量高折光的漂浮细胞,大部分为死亡,少量为凋亡细胞。SF组细胞状态较NC组稍差,但细胞状态明显优于HR组,高亮细胞明显减少,细胞分界较清楚；NA组细胞则较SF组状态差。说明舒芬太尼预处理对细胞缺氧复氧损伤的保护作用可以被纳洛酮所消弱。
　　 2.细胞活力的变化
　　 缺氧复氧损伤可使细胞活力显著下降,HR组细胞活力较NC组细胞活力显著降低,HR组细胞活力仅为NC组的53％(P<0.01)；舒芬太尼预处理可使细胞活力明显增加。与HR组比较,从舒芬预处理组SF10组起到SF6组细胞活力升高,且有统计学差异(P<0.05)。舒芬预处理各组细胞活力随舒芬太尼浓度升高而有上升趋势,且自SF9组开始有饱和趋势。纳络酮可消除舒芬太尼预处理维持细胞活力的作用,与SF组比较,NA组细胞活力显著下降(P<0.05)。
　　 3.培养液中LDH的变化
　　 与NC组比较,HR组和NA组培养液中LDH含量显著增多(P<0.01),与单纯缺氧复氧损伤细胞相比,舒芬太尼预处理可使培养液中LDH含量显著减少(P<0.01)。且舒芬太尼预处理对LDH含量的影响同样有浓度依赖性,自SF9组开始有饱和趋势。
　　 4.细胞内SOD含量的变化
　　 缺氧复氧可使HR组细胞内SOD活性显著下降(P<0.01),而舒芬太尼预处理可有效阻止SF组细胞SOD活性的减低,但这种保护效应可被纳络酮消除,纳洛酮组细胞内SOD活性与HR组相比差异无统计学意义。
　　 5.高糖对细胞缺氧复氧损伤后MTT、LDH及SOD的影响
　　 在高糖环境下,细胞通过缺氧复氧后也发生明显的损伤,MTT下降,LDH含量明显升高,SOD活性显著降低；舒芬太尼预处理可以减轻细胞的损伤,这种保护作用同样可以被纳洛酮阻断。但是,高糖环境下细胞的损伤程度却小于正常糖环境下(P<0.05)。细胞的损伤程度即为在正常对照组基础上,模型组细胞的MTT、LDH含量及SOD的变化值占对照组的百分比。舒芬太尼对细胞损伤的保护程度在两种环境下无显著性差异(P>0.05)。舒芬太尼对细胞损伤的保护程度即与模型组相比,舒芬太尼预处理组细胞的MTT下降、LDH含量降低及SOD含量的升高部分占模型组数值的百分比。
　　 6.细胞内目的蛋白表达及细胞凋亡率的变化
　　 Western结果显示,NC组细胞内Caspase-3(17KD)未见表达。与NC组相比,HR组cleaved caspase-3(17KD)蛋白表达量明显增多,而舒芬太尼预处理可使这种蛋白表达量显著少于模型组(P<0.01)；纳络酮可阻断舒芬太尼的这种效应,NA组细胞cleaved caspase-3(17KD)蛋白表达量与HR组相比无统计学意义(F>0.05)。流式细胞术也发现,舒芬太尼预处理可以减少缺氧复氧引起的细胞的凋亡,舒芬太尼的这些变化可以被纳洛酮所阻断。
　　 7.相关分析
　　 相关分析结果表明,H9C2细胞活力与培养液上清LDH释放量呈负相关(r=-0.818,P=0.000)。
　　 结论
　　 本实验通过对细胞造成缺氧复氧损伤模型,模拟心肌缺血再灌注,测定细胞形态、活力,抗氧化指标、凋亡情况及部分信号传导通路的变化得到如下结论:
　　 (1)缺氧复氧对细胞造成明显损伤,引起细胞功能改变,凋亡增加。
　　 (2)舒芬太尼预处理对高糖和正常环境下的心肌细胞的缺氧复氧损伤都有较好的保护作用；
　　 (3)舒芬太尼预处理对细胞缺氧复氧损伤的保护作用有浓度依赖性,且有饱和浓度(浓度≥10-9mol/L时,从细胞活力和培养液LDH浓度方面可看出保护作用基本达到饱和)。
　　 (4)在正常糖培养下,高糖对细胞有损伤作用；在缺氧复氧损伤时,高糖对细胞损伤有一定程度的保护作用。
　　 (5)舒芬太尼可能通过以下机制起到对缺氧复氧损伤后心肌细胞的保护作用。
　　 ①提高细胞抗氧化能力,维持细胞活力,稳定细胞膜、减少细胞内LDH的漏出,提高细胞内SOD的活性,减少细胞凋亡；
　　 ②活化PI3K/Akt通路,发挥抑制细胞凋亡及其它保护作用；
　　 ③降低丝裂原蛋白激酶p38的活化；
　　 ④减少细胞周期蛋白p27的表达。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 舒芬太尼预处理对}t9C2细胞缺氧复氧损伤后细胞活力和乳酸脱氢酶活性的影响

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第二部分 舒芬太尼预处理减轻H9c2细胞缺氧复氧损伤降低细胞凋亡率

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

第三部分 舒芬太尼预处理对高糖环境下及正常环境下H9c2细胞缺氧复氧损伤的保护作用

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 参考文献

结论

中英文缩写对照表

攻读学位期间的成果

致谢

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