卒中后抑郁与CREB1基因多态性相关分析

摘要

研究背景:
　　 脑卒中是严重危害人类健康的常见病、多发病,除引起多种躯体功能障碍外,还出现不同程度的认知和语言功能障碍,常导致产生一系列感情行为的变化等各种心理问题,其中抑郁是脑卒中后常见的心理障碍,称之为脑卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)。脑卒中后抑郁不仅阻碍躯体残疾的康复,增加脑卒中患者的死亡率、复发率,其本身亦严重影响患者的生活质量,是脑卒中致残的重要因为之一。脑卒中患者中抑郁的发病率明显高于普通人群,在综合医院不同疾病患者伴发抑郁障碍比例中脑卒中患者伴发抑郁比例较高,国内报道发病率为31.2％～63.1％,国外报道为25％～79％,从大量的临床报道可见PSD的发生率集中在40％～50％。随着生物医学模式向生物-心理-社会医学模式的转换,卒中后抑郁及卒中后抗抑郁药物治疗备受重视。
　　 卒中后抑郁症的发病机制尚不明确,涉及生物学机制(与心境调节有关的神经化学、神经传导通路,疾病遗传易感性)及社会心理应激等多方面。长久以来,学者们围绕着单胺能假说研究,与单胺神经能递质5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)等代谢、转运、调节有关的基因一直是研究热点,但多发现上述神经递质的降低或增高与抑郁发病无明确联系,基因方面研究也没有得到一致的结果。因此有人推测抑郁症发生的关键可能不局限于受体或受体前,于是最近陆续出现了抑郁症与G蛋白β3基因、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)基因、脑源性神经营养因子(BDNF)基因与抑郁发生的关联研究。这些基因主要与神经元轴突生长分化、神经营养、突触可塑性等受体后信号传导通路相关,提示卒中后抑郁可能存在信号通路、神经营养等方面的异常改变。
　　 Walton等研究中度脑缺氧缺血(hypoxic-ischemia,HI)后,凋亡耐受神经元(齿状回颗粒细胞)的CREB磷酸化作用呈迟发增高,而在死亡过程中的CA1锥神经元CREB(磷酸化的和非磷酸化的)则急剧丧失,从而推断在细胞死亡开始之前,支持活化的CREB对海马神经元的细胞生存有着重要的作用。在他们的另一个全脑缺血模型中该推断也得到了证实。Tanka等研究局灶性脑缺血后,梗死周围区磷酸化的CREB(pCREB)水平显著高,而梗死中心区CREB免疫反应细胞数则显著减少。
　　 缺血性脑损伤后存在细胞死亡和细胞存活两种平行机制,在神经元缺血后存活机制中,CREB可能起关键作用,而抗抑郁药作用机制是通过激活多条信号转导通路,最终引起核转录因子CREB磷酸化,进而调节许多促进细胞生长、增殖、存活和神经可塑性的基因表达,如BDNF、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF2Ⅰ)、激活素(activin)等,发挥抗抑郁效应。因此学者认为CREB在卒中后抑郁的关键性因子之一。
　　 CREB作为神经系统细胞内信号转导的交汇点,是多种蛋白激酶的磷酸化底物,其中最早被确认的为蛋白激酶A(PKA)。当胞浆中的cAMP浓度升高时,PKA能特异性识别CREB的Ser133磷酸化位点,促使CREB结合蛋白(CBP)与CREB结合,从而使转录过程增强。其他能使CREB磷酸化的蛋白激酶还有Ca2+依赖的蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶CK11和钙-钙调蛋白激酶CaMK、MAP激酶等。CREB作为一个重要的整合器,将影响神经可塑性和神经元存活的细胞外刺激进行整合,来影响下游靶基因(包括BDNF基因)的表达。
　　 CREB是作为记忆功能蛋白在1986年被Montminy、Short及Comb发现并命名的。他们分别在脑啡肤原、烯醇丙酮酸磷酸梭激酶基因5’端转录调控区内发现的一段长约3ObP的cAMP应答序列,为细胞核内的一种调控因子,是转录因子中亮氨酸锌指家族的主要成员之一,为许多基因的转录诱导所必需,因而又被称为转录增强因子。CREB在大脑皮层与海马组织均有广泛表达,其中CREB在大脑的分布:CREB在分子层内的神经元、颗粒层的星形细胞及锥体细胞层细胞核内均有棕黄色颗粒的阳性表达,尤其在外颗粒层的细胞核内表达最深；CREB在海马组织的分布:以海马齿状回的颗粒细胞层着色最深,呈棕黄色,CA3区次之,CA1去着色最淡。
　　 多项临床前期和临床研究均表明CREB在抑郁症的病理生理机制和抗抑郁治疗的作用机制中可能具有重要作用,抗抑郁药可以引起CREB表达增加。动物实验中慢性给予氟西汀,可以提高大鼠杏仁核、皮层、海马等多个脑区磷酸化CREB水平,而去甲丙米嗪只提高海马齿状回磷酸化CREB水平。用BrdU标记新生海马神经元,该神经元在形成后1～2周开始表达磷酸化CREB,在4周时磷酸化CREB表达降低,提示磷酸化CREB可能主要在海马神经元早期存活中起作用；Hastings等2002年研究提示CREB可能是通过阻止凋亡,以确保存活到成熟神经元。Lai等临床研究显示,用RT2PCR的方法检测重症抑郁症患者外周白细胞CREBmRNA在抗抑郁治疗前后的表达,并与正常人作对照,结果显示CREB mRNA表达在正常人和患者之间没有明显差异,但是在经8周抗抑郁治疗后的患者中表达明显下降,这种改变与抗抑郁药类型和疗效无关。此项临床研究从另一方面提示,CREB在外周表达的规律与中枢可能不同,提示评价CREB在慢性抗抑郁治疗中的作用尚有待深入。抑郁症可能存在CREB及p-CREB介导的调控过程异常,而CREB可能是抗抑郁药及ECT治疗的共同受体后靶点,这也可以部分解释抗抑郁药起效延迟的因为。此外,有研究者已经提出cREB水平的变化可作为抑郁症患者患病及其抗抑郁治疗疗效预测的状态性标志。己知编码人类CREB1基因定位于染色体2q32-q34,zubenko等曾经报道他们在染色体2q33-34上包含CREB1基因在内的451kb区域内找到了与抑郁症连锁的证据,且这种连锁关系仅见于女性。因此,从基因的染色体定位及其功能上均提示我们cREB1基因可能是卒中后抑郁的候选基因。
　　 目的
　　 本实验目的在于探讨CREB1基因两个SNP位点rs10932201和rs6740584多态性与卒中后抑郁遗传易感性的关系,为下一步的基因诊断、基因治疗、抗抑郁药物研究提供理论依据。
　　 方法
　　 以珠江医院神经内科住院病人作为研究对象,病例组根据第四次全国脑血管学术会议做出中风诊断和汉密尔顿抑郁量表做出抑郁诊断,按入组条件及排除标准入组病例(脑卒中后抑郁组)组50例,分为对照50例。被试者抽全血2mL,EDTA抗凝后采用苯酚-氯仿抽提法提取外周血白细胞基因组DNA。利用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性技术,应用上游5’-TAC CTC CCC AGCCCT TAG-3’,下游为:5’-GGA AGC AGT CCA ATA GAA CA-3’引物扩增CREB1基因SNP rs10932201,用Hinf Ⅰ内切酶检测rs10932201 G→A多态性；应用上游5’-GAG GTT GAG TCT GGA GGA T 3’,下游5’-TAT TGG AAA GGT GGAGGA C-3’引物扩增 CREB1基因SNP rs6740584,用Ssp Ⅰ内切酶检测rs6740584C→T多态性。比较基因频率和基因型运用SPSS13.0统计软件包,采用卡方检验计算单纯卒中患者与卒中后抑郁患者之间各等位基因频率或突变频率分布。
　　 结论
　　 CREB1 rs10932201SNP位点与PSD遗传易感性无关联；CREB1 rs6740584SNP位点与PSD遗传易感性有明确的相关性,提示携带突变基因T可以增加PSD的发病率,其功能的变化可能影响CERB的表达从而影响神经系统细胞内信号转导,这种关系主要见于女性患者。表明CREB1基因rs6740584可能在女性中风后抑郁症的遗传学发病机制中起重要作用,CREB1基因可能是女性中风后抑郁症的易感基因。这为下一步的基因诊断、基因治疗、抗抑郁药物研究提供了理论依据,进一步研究CREB水平的变化PSD关系可能发现PSD患者及其抗抑郁治疗效果的新指标。

目录

文摘

英文文摘

前言

1.对象、材料和方法

2.实验结果

3.讨论

4.结论

参考文献

附表一汉密尔顿抑郁量表(HAMD)

综述脑卒中后抑郁与细胞内信号转导相关研究

参考文献

中英文名词对照与缩写

致谢

统计学审稿证明