虫草素、普伐他汀对肿瘤坏死因子α诱导大鼠血管平滑肌细胞syndecan-4蛋白表达的影响

摘要

研究背景：
　　 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致心血管疾病的重要因为之一。日益增多的证据表明,动脉粥样硬化是一个对血管损伤的过度炎症反应。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和表型改变是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的主要病理基础之一。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha,TNF-α)是炎症反应的关键调节因子之一,可从多种不同的炎症细胞中释放,在动脉粥样硬化发生发展中起着关键的作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)类的跨膜转运蛋白多糖syndecans家族的成员之一。Syndecan-4在多种细胞均有表达,它在非哺乳动物中的主要作用是促进神经系统的发育,在哺乳动物中调控着多种细胞生物学效应,在细胞的伸展、识别、粘附、迁移和增殖控制中扮演着重要的角色,同时也介导炎症反应[1]。虫草素(cordycepin)即3’-脱氧腺苷,为含氮配糖体的核酸衍生物,为冬虫夏草的主要药理活性成分之一,既往的研究表明,虫草素具有抗炎和免疫调节等作用[2];目前包括普伐他汀在内的他汀类药物已经成为冠心病治疗的基石,它通过竞争性抑制胆固醇合成的限速3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA),从而降低胆固醇的合成。然而,他汀类药物具有不依赖于其降血脂特性的抗炎功效,能抑制许多炎症因子的表达和降低许多血清炎症标志物,对炎症反应过程各阶段均有抑制作用[2]。
　　 目的：
　　 分别以虫草素(cordycepin)和普伐他汀(pravastatin)为研究对象,通过体外培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,了解虫草素和普伐他汀对TNF-α诱导的大鼠胸主动脉VSMCs细胞syndecan-4蛋白表达的影响,进一步从细胞和分子水平上阐述syndecan-4蛋白在动脉粥样硬化发生发展中的作用。
　　 方法
　　 1.细胞增殖的检测:
　　 实验一:应用96孔板体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素、20μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时。每组浓度设6个副孔,同样实验条件重复6次,每组共36例实验数据,并设立对照组进行比较,采用MTS/PMS法确定大鼠胸主动脉VSMCs的增殖状态。
　　 实验二:应用96孔板体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时。每组浓度设13个副孔,同样实验条件重复2次,每组共26例实验数据,并设立对照组进行比较,采用MTS/PMS法确定SD大鼠胸主动脉VSMCs的增殖状态。
　　 2.Syndecan-4蛋白表达的检测:
　　 实验一:体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素、20μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blotting蛋白免疫印迹法测定大鼠胸主动脉平滑肌细胞syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共3例实验数据,并设立对照组进行比较。
　　 实验二:体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,用终浓度为20ng/mL TNF-α、10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀、10μmol/mL普伐他汀联用20ng/mLTNF-α、20μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α分别作用24小时,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用Western blotting蛋白免疫印迹法测定大鼠胸主动脉平滑肌细胞syndecan-4蛋白的表达情况。每组浓度重复实验3次,共3例实验数据,并设立对照组进行比较。
　　 结果
　　 1、虫草素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响
　　 MTS/PMS法测定各组细胞增殖率分别为:对照组0.666±0.098,TNF-α20ng/mL组1.014±0.149,20μmol/mL虫草素组0.660±0.097,40μmol/mL虫草素组0.676±0.085,TNF-α 20ng/mL联用20μmol/mL虫草素组0.662±0.107,TNF-α20ng/mL联用40μmol/mL虫草素组0.627±0.135。统计分析结果表明,与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05),而20μmol/mL虫草素、40μmol/mL虫草素组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无显著影响(P>0.05)。20μmol/mL虫草素联用20ng/mL TNF-α、40μmol/mL虫草素联用20ng/ml TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对VSMCs增殖均有显著的抑制作用(P<0.05)。
　　 2、虫草素对TNF-α诱导的大鼠VSMCs syndecan-4蛋白表达的影响
　　 以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1,其余各组syndecan-4蛋白表达量分别为:TNF-α 20ng/mL组1.375±0.017,20μmol/mL虫草素组1.009±0.112,40μmol/mL虫草素组1.002±0.051,TNF-α20ng/mL+20μmol/mL虫草素组0.962±0.057,TNF-α 20ng/mL+40μmol/mL虫草素0.914±0.057(如图2)。统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表达(P<0.05)；而虫草素不同剂量组单独应用对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均无显著作用(P>0.05)。TNF-α联合虫草素共同作用组与TNF-α组比较对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均有显著抑制作用(P<0.05)。
　　 3、普伐他汀对TNF-α诱导的大鼠VSMCs增殖的影响
　　 MTS/PMS法测定各组细胞增殖率分别为:对照组0.625±0.133,TNF-α20ng/mL组1.069±0.146,10μmol/mL普伐他汀组0.635±0.134,20μmol/mL普伐他汀组0.651±0.134,TNF-α20ng/mL联用10μmol/mL普伐他汀组0.684±0.128,TNF-α 20ng/mL联用20μmol/mL普伐他汀组0.630±0.145。统计分析结果表明,与对照组比较,20ng/mL TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.05),而10μmol/mL普伐他汀、20μmol/mL普伐他汀组单独应用对大鼠VSMCs的增殖均无显著影响(P>0.05)。10μmol/mL普伐他汀联用20ng/mL TNF-α、20μmol/mL普伐他汀联用20ng/ml TNF-α组与20ng/mL TNF-α组比较对VSMCs增殖均有显著的抑制作用(P<0.05)。
　　 4、普伐他汀对TNF-α诱导的VSMCS细胞syndecan-4蛋白表达的影响
　　 以目的蛋白对照组灰度值与内参对照组灰度值的比值为1,其余各组syndecan-4蛋白表达量分别为:TNF-α20ng/mL组1.340±0.050,10μmol/mL普伐他汀组1.023±0.035,20μmol/mL普伐他汀组1.010±0.072,TNF-α20ng/mL+10μmol/mL普伐他汀组0.967±0.038,TNF-α 20ng/mL+20μmol/mL普伐他汀0.923±0.038。统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激VSMCs的syndecan-4蛋白表达(P<0.05);而普伐他汀不同剂量组单独应用对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均无显著作用(P>0.05)。TNF-α联合普伐他汀共同作用组与TNF-α组比较对VSMCs的syndecan-4蛋白表达均有显著抑制作用(P<0.05)。
　　 结论
　　 综上所述,本研究证明了一定剂量的虫草素和普伐他汀能够显著抑制TNF-α诱导的大鼠VSMC增殖和syndecan-4蛋白表达。因此,有必要进一步研究虫草素和普伐他汀抑制syndecan-4蛋白表达的相关潜在靶点,为动脉粥样硬化的防治提供一定的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 虫草素对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响

材料和方法

实验技术路线

结果

讨论

结论

第二部分 普伐他汀对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖及syndecan-4蛋白表达的影响

材料和方法

实验技术路线

结果

讨论

结论

全文总结

创新、展望与不足

参考文献

主要缩略词表

综述一

参考文献

综述二

参考文献

论文发表情况

致谢

统计学证明