多发性骨髓瘤微小RNA基因序列突变的实验研究

摘要

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种B细胞性恶性肿瘤,以骨髓中浆细胞恶性克隆增生,血清或尿液中出现单克隆免疫球蛋白或其成分M蛋白,正常免疫球蛋白受到抑制以及广泛溶骨病变和/或骨质疏松为特征。多发性骨髓瘤在我国的发病率约为十万分之一至十万分之二,仅次于急性白血病,位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位,且有增长趋势。97％-99％的患者诊断时年龄超过40岁,随着年龄的增高发病率逐步增加,特别多发于60岁以上的老年人。尽管近年来在药物治疗方面有一些进展,大部分多发性骨髓瘤患者还是由于复发和疾病进展而不能治愈。随着我国进入老龄化社会,这种老年性恶性疾病越来越常见,严重影响患者的生存时间及生活质量。
　　 目前人们对多发性骨髓瘤的发病机制还不清楚,已有的研究结果显示主要与遗传学改变和细胞因子的作用两方面有关,但至今没有明确的答案。由于这种疾病的发生发展涉及多个复杂的分子调控机制,研究进展相当缓慢。微小RNA(micro RNA,miRNA)的发现为这方面的研究提供了一个新的思路,miRNA是一类广泛存在于真核细胞胞质内的单链小分子RNA,来源于内源性的发夹样转录产物,长约18～25nt,不具有开放阅读窗(ORF),不编码蛋白质,作为一种序列特异、转录后抑制基因表达的调节因子,通过与互补mRNA完全或不完全配对,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。miRNA有几百个靶基因,调控着一半以上的人类蛋白编码基因。通过调控靶基因miRNA参与生命过程中一系列重要进程,包括个体发育、造血生成、器官形成、细胞凋亡、细胞增殖与分化、脂肪代谢等。50％以上的miRNA位于人类基因组地图与肿瘤有关的区域,提示miRNA在肿瘤的发生中发挥了很重要的作用。目前已有研究发现miRNA的表达模式与遗传学异常有关,如miR-1和miR-133a具有相同的染色体位点,在t(14；16)异常的的病例中过表达。一些miRNA在多发性骨髓瘤中选择性上调,并与一些肿瘤基因显著相关,如miR-181a和miR-181b在MM中高表达,miR-17和miR-32在MM及细胞系中选择性上调而在正常组中无上调。miR-19a和miR-19b可下调抑癌基因SOCS-1的表达(SOCS-1在MM中常被沉默,作为IL-6抑制物发挥重要作用)。MM中miR-335,miR-342-3p,miR-561与三个过表达的宿主基因显著相关,可能在细胞归巢及与骨髓微环境的相互作用中发挥重要作用。通过文献复习,在多发性骨髓瘤中表达异常的12种miRNA整理如下:miR-17,miR-32,miR-19a,miR-19b-1,miR-19b-2,miR-181a-1,miR-181a-2,miR-181b-1,miR-181b-2,miR-335,miR-342,miR-561。鉴于以上研究结果所显示miRNA与MM的密切关系,对上述miRNA的深入研究显得尤为重要。
　　 miRNA的生成历经以下几个过程:基因转录产生长约300-1000bp的初始转录产物-原始微小RNA(pri-miRNAs),再由微小前体复合物(‘Microprocessor’-complex)加工成约70-90nt发灾样前体RNA(pre-miRNA)；Pre-miRNA在exportin-5的作用下转运进入胞质,被另一个双链RNA特异性RNaseⅢ-Dicer。识别,进一步切割成长约18-25 nt的小分子RNA,即成熟的miRNA。由于miRNA的表达具有保守性,其基因序列的改变可能对下游的酶切修饰产生重大影响,从而在整个发病过程中发挥作用。包括原始微小RNA(pri-miRNAs)、前体微小RNA(pre-miRNAs)和成熟微小RNA(mature miRNA)的序列改变都会对miRNA的加工、选择过程产生影响。国外研究表明存在于pri-miRNA中的序列突变会影响pre-miRNA的成熟,存在于成熟miRNA中的突变会直接影响miRNA的表达、成熟过程和与目标区域的结合。另外,miRNA中突变的目标区域序列会改变miRNA的活性和(或)影响其目的基因的表达。目前关于miRNA基因突变对肿瘤发生影响的研究还只限于急性髓细胞白血病,淋巴瘤,肝癌等,在多发性骨髓瘤中的研究还未见报道。因此本实验主要就多发性骨髓瘤中12个表达异常的miRNA基因序列突变进行研究,采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染法检测4种人多发性骨髓瘤细胞系(KM-3,ARH-77,U266,RPMI8226)、20例多发性骨髓瘤患者和20例治疗后血液学指标恢复正常的非血液肿瘤患者骨髓标本中上述12种miRNA基因突变情况,实验数据经常规统计方法检验差异的显著性,并就检测结果分析其病理生理学及临床意义,为多发性骨髓瘤分子生物学诊断和分子靶向治疗奠定理论基础。
　　 目的：了解多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者中微小RNA(MicroRNA,miRNA)基因是否存在突变,与肿瘤发生有无关系,有何临床意义。
　　 方法：采集20例多发性骨髓瘤患者及20例治疗后血液学指标恢复正常的非血液肿瘤患者骨髓标本,病例组骨髓细胞经CD138阳性免疫磁珠分离纯化浆细胞,流式细胞仪检测纯度；对照组骨髓标本提取单个核细胞:4种人多发性骨髓瘤细胞系培养传代。病例组,对照组及细胞系标本分别提取基因组DNA,采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)银染法检测上述标木中12种miRNA(miR-17,miR-32,miR-19a,miR-19b-1,miR-19b-2,miR-181a-1,miR-181a-2,miR-181b-1,miR-181b-2,miR-335,miR-342,miR-561)基因突变,病例组与对照组突变率经Fisher精确概率法检验,以P<0.05为差异有统计学意义。实验结果结合临床分析。
　　 结果：人多发性骨髓瘤细胞系KM-3,RPMI8226检测出miRNA-335基因突变；20例多发性骨髓瘤患者中3例检出突变,其中miR-19a,miR-19b和miRNA-335基因突变各一例,病例组总突变率为15％；正常对照组未检出突变。统计学结果显示P>0.05,两组突变率差异无统计学意义,尚不能认为病例组突变率大于对照组。病例组突变者中1例已死亡,2例检测突变时已处于疾病终末期。
　　 讨论：通过以上实验研究,我们掌握了细胞培养、单个核细胞提取及CD138+细胞的分离、多聚酶链反应-单链构象多态性分析等实验技巧。首次在多发性骨髓瘤患者及人多发性骨髓瘤细胞系KM-3,RPMI8226中检测出了miRNA基因miR-19a,miR-19b和miRNA-335存在的序列突变:多发性骨髓瘤细胞系KM-3和RPMI8226检测出miRNA-335基因突变；20例MM患者中3例发生突变,其中miR-19a,miR-19b和miRNA-335基因突变各一例,病例组总突变率为15％；对照组20例未检出突变。统计结果显示病例组与对照组突变率差异无统计学意义,尚不能认为病例组突变率大于对照组。实验结果提示miRNA基因miR-19a,miR-19b和miRNA-335在MM中存在突变,突变的特异性还需进一步验证。miRNA基因序列突变可能与多发性骨髓瘤发病机制相关,鉴于该miRNA的靶基因SOCS-1及MEST在多发性骨髓瘤发病机制中发挥重要作用,其序列突变看似包含着下游调节异常的重要机制。对病例组实验组结果结合临床进行分析:病例组突变者中1例已死亡,2例检测突变时已处于疾病终末期。临床特征显示发生miR-19a,miR-19b和miRNA-335基因突变的病例预后差于未检出突变者,miR-19a,miR-19b和miRNA-335突变可能与疾病进展预后有关,对突变的检测可能有助于分析MM病程进展和预后的分析。
　　 结论：miRNA基因序列在多发性骨髓瘤患者及人多发性骨髓瘤细胞系中存在一定的突变率,发生突变的3种miRNA基因分别是miR-19a,miR-19b和miRNA-335,在血液学正常的对照组中尚未发现上述突变。上述突变是否具有特异性需要扩大检测样本量进一步验证。miR-19a,miR-19b和miRNA-335基因序列突变可能与多发性骨髓瘤发病机制有关,序列突变有可能是其目的基因SOCS-1及MEST调控异常的因为之一,具体机制还需要进一步研究。临床特征提示发生miR-19a,miR-19b和miRNA-335基因突变的患者疾病预后差,突变的检测可能有助于病程进展和预后的分析,有望成为多发性骨髓瘤新的疾病检测标志和预后推测指标,具有重要的理论和临床意义。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

多发性骨髓瘤微小RNA基因序列突变的实验研究

摘要

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

五、参考文献

文献综述

参考文献

研究生期间成果

中英文缩写对照表

致谢

统计学证明