芥菜籽预防化学诱导小鼠大肠肿瘤的实验研究

摘要

研究背景与目的：
　　 大肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。在北美、欧洲各国,大肠癌占全部癌症死亡因为的第2位。在我国,随着社会经济的发展,生活方式和饮食习惯的改变,大肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前对大肠癌的治疗采取的是一种包括手术、放疗、化疗以及生物、免疫治疗等在内的综合治疗,但不管采用哪种手段,大肠癌的总体治愈率仍徘徊在50％左右,长期生存率和生活质量仍不理想。因而,大肠癌的化学预防逐渐成为近年来研究的焦点。化学预防是应用天然产物和(或)人工合成的化学物质来逆转、抑制或预防肿瘤的发生、进展和转移。大肠癌的发生发展是多因素、多阶段、多步骤的过程,是环境因素与机体遗传因素相互作用的结果。正常肠粘膜上皮细胞演变为癌细胞的历程有数十年,这就为化学预防提供了良好的干预时机。目前通过膳食中存在的天然抗癌成分来防癌是最有希望和潜力的肿瘤防治方法。天然化学预防药物与人工合成的化学物质相比,更具安全性和实用性,也更易为人体所接受。
　　 流行病学研究发现,经常食用辣根、甘蓝、花椰菜、卷心菜等十字花科蔬菜能降低人类前列腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌和结肠癌等的患病危险。芥菜籽(mustard seed,MS)是十字花科芸苔属植物芥菜的种子,其加工的产品芥末油和芥未粉是我们生活中常用的调味品。《中国药典》记载:芥菜籽性温,味辛,归肺、胃经。功擅温中散寒、豁痰利窍、通络消肿,常用于治疗寒痰喘咳、胸胁胀痛、肢体麻木、关节疼痛、阴疽肿毒等疾病。近年来有研究发现,芥菜籽及其活性提取物都具有抗癌防癌的活性。在二甲基苯并蒽(DMBA)诱发小鼠肿瘤模型中,芥菜籽油能够降低DMBA经胎盘和哺乳的致癌性,实验组妊娠小鼠给予芥菜籽油,子代小鼠肿瘤发生率16％,对照组妊娠小鼠给予玉米油,子代小鼠肿瘤发生率为70％。芥菜籽的醇提取物在DMBA诱发瑞士白化小鼠皮肤癌模型中,能使实验组小鼠肿瘤发生率下降50％。Gagandeep等报道在苯并芘[B(a)P]诱导小鼠胃癌和甲基胆蒽(MCA)诱导小鼠宫颈癌模型中,实验组给予含5％芥菜籽的饲料,对照组为标准饲料,结果实验组胃癌发生率降低28％,宫颈癌发生率降低60％。芥菜籽能否作为一种化学预防剂应用于大肠癌的预防,目前这方面的研究不多,同时芥菜籽抗癌的作用机制还不清楚。
　　 近年来自由基与肿瘤关系的研究日益受到重视。研究结果发现,自由基不仅损伤细胞,导致细胞结构和功能改变,在致癌和促癌过程中也起重要的作用。自由基是具有不配对电子的原子、原子团、分子或离子,对正常生命活动的许多重要反应必不可少,它参与多种生物活性物质的合成、解毒反应、吞噬细胞杀灭细菌等过程。但是当外界有毒的物理化学因素如放射线、毒物、化学致癌物等作用于机体后,自由基的产生与清除平衡严重失调,则会导致广泛的损伤效应。自由基能引起细胞膜脂质过氧化,改变蛋白质、酶的活性,损伤线粒体,攻击DNA,诱发基因突变。生物机体主要通过自由基清除酶来防止自由基损伤,目前已知生物体内的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等,它们可分别作用于自由基链锁反应的不同环节,在体内担负着清除自由基的重要任务。SOD是清除机体内超氧阴离子自由基(O2-·)的重要生物酶,它可以催化O2-·的歧化反应,产生活性相对较低的过氧化氢(H2O2),CAT的主要作用是催化H2O2,GSH-Px能够清除H2O2及脂类氢过氧化物。脂质过氧化是自由基引起细胞损伤的主要途径,丙二醛(MDA)是其主要终末产物。通常用MDA的水平来反映生物体内脂质过氧化状态和机体受损伤的程度。上述指标可以综合反应机体内过氧化的程度和抗自由基氧化的能力。
　　 动物肿瘤模型是目前研究肿瘤病因、预防、早期诊断和治疗的重要工具。大肠癌常用的动物模型是化学致癌,其中研究最多和应用最广泛的大肠特异性致癌物是二甲基肼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)。AOM是DMH的代谢中间产物,具有比DMH更强的致癌性和化学稳定性。它是一种强氧化剂,可导致细胞膜以及DNA过氧化损伤,引起基因突变,从而使细胞过度增殖,形成特异性的大肠肿瘤。AOM诱导小鼠大肠癌的发生是一个长期的多阶段的过程,与人类大肠癌发生过程中细胞动力学、病理组织学和分子特征方面的变化特点非常相似。
　　 基于以上研究背景,本实验以氧化偶氮甲烷(AOM)化学诱导的小鼠大肠肿瘤为研究对象,初步研究芥菜籽对AOM化学诱导的小鼠大肠肿瘤的预防作用,免疫组化检测小鼠大肠肿瘤组织的增殖和凋亡情况；观察芥菜籽对小鼠体内氧自由基水平和抗氧化酶活性的影响,从自由基反应与肿瘤发生的角度探讨芥菜籽预防大肠癌发生的作用机制,为芥菜籽应用于大肠癌的化学预防提供实验依据和理论指导。
　　 材料和方法
　　 1、选取60只昆明种雌性小鼠(体重18～20 g)为实验对象,随机均分为AOM模型组、AOM+5％MS干预组、AOM+10％MS干预组和正常对照组。小鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg.wt),每周1次,连续3周,建立大肠癌动物模型；
　　 2、观察各组小鼠的一般状态,如摄食及饮水情况、营养状况、体重、活动状态、毛色、光泽度变化、大便性状等方面的改变情况。实验36周时处死小鼠,留取血清,分离大肠,预冷生理盐水冲洗肠内容物；
　　 3、观察记录各组小鼠肿瘤发生的部位、数目和大小,计算各组小鼠肿瘤发生率、平均肿瘤数和抑瘤率,同时观察其它脏器有无转移灶发生；
　　 4、肿瘤组织常规固定脱水,石蜡包埋切片,H.E染色观察,确定肿瘤的组织学类型;
　　 5、免疫组织化学染色检测肿瘤组织中PCNA蛋白的表达水平,计算肿瘤细胞增殖指数(PI);
　　 6、TUNEL染色检测肿瘤组织凋亡情况,计算肿瘤细胞凋亡指数(AI)；
　　 7、比色法检测各组小鼠血清中抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)的活力和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平。
　　 结果
　　 1.实验终末期,AOM模型组小鼠出现消瘦衰竭、厌食、脱毛、血便等表现,其中有2只小鼠伴有腹水。AOM模型组小鼠体重较正常对照组显著降低(P<0.05),MS干预组小鼠体重较AOM模型组增加(P<0.05),而MS干预组之间的小鼠体重无显著性差异(P>0.05)。
　　 2.正常对照组小鼠无肿瘤发生,AOM模型组小鼠肿瘤发生率为86.7％(13/15),5％MS干预组肿瘤发生率为60.0％(9/15),10％MS干预组肿瘤发生率为41.7％(5/12)。三组小鼠肿瘤发生率之间的差异有统计学意义(X2=6.607,P=0.048)。
　　 3.AOM模型组小鼠平均肿瘤数为2.20±1.21个,而5％MS干预组小鼠平均肿瘤数减少为1.07±1.10个(P<0.05,与模型组相比),抑瘤率为51.4％；10％MS干预组小鼠平均肿瘤数减少为0.67±0.89个(P<0.05,与模型组相比),抑瘤率达69.5％。
　　 4.AOM模型组、5％MS和10％MS干预组肿瘤细胞增殖指数(PI)分别为:59.9±4.4、41.7±4.9和32.0±3.9,其中10％MS干预组肿瘤细胞的PI明显低于AOM模型组和5％MS干预组,差异具有显著性(P<0.05)。
　　 5.AOM模型组、5％MS和10％MS干预组肿瘤细胞凋亡指数(AI)分别为:6.9±1.4、9.3±1.5和15.0±2.4,其中10％MS干预组肿瘤细胞的AI明显高于AOM模型组和5％MS干预组,差异具有显著性(P<0.05)。
　　 6.AOM模型组小鼠血清抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX的活力明显低于正常对照组,差异具有显著性(P<0.05)；MS干预组小鼠血清SOD、CAT、GSH-PX的活力与AOM模型组相比均有所提高,具有显著性差异(P<0.05)；其中10％MS干预组增加小鼠血清抗氧化酶活力的作用最明显,与5％MS干预组相比差异具有显著性(P<0.05)。
　　 7.AOM模型组小鼠血清脂质过氧化产物(MDA)的含量明显高于正常对照组,差异具有显著性(P<0.05)；MS干预组小鼠血清MDA的含量与AOM模型组相比均有所下降,具有显著性差异(P<0.05)；其中10％MS干预组降低小鼠血清MDA的效果最明显,与5％MS干预组相比差异具有显著性(P<0.05)。
　　 结论
　　 1.芥菜籽对AOM诱导的小鼠大肠肿瘤具有化学预防作用,能明显降低AOM诱导的小鼠大肠癌发生率和减少小鼠的平均肿瘤数。随着芥菜籽浓度的增加,其预防大肠癌发生的作用增强。
　　 2.芥菜籽能降低小鼠大肠肿瘤组织中PCNA的表达水平,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。
　　 3.在AOM诱导肿瘤过程中,芥菜籽能提高小鼠血清中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX的活性,降低血清中脂质过氧化产物MDA的水平；其预防大肠癌的作用机制可能与它的抗氧化作用有关,通过增强体内抗氧化的能力,减少自由基对细胞的损伤,预防基因突变和肿瘤发生。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言

第二章 材料和方法

第三章 结果

第四章 讨论

全文小结

参考文献

中英文缩略对照词表

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明