鼻咽癌的细胞毒性T细胞免疫治疗的定量研究

摘要

鼻咽癌(NPC)是我国华南及东南亚地区常见的肿瘤之一。EB病毒存在于所有低分化和未分化鼻咽癌中,肿瘤表达的病毒抗原为免疫治疗提供了靶标。EBV特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫治疗对骨髓和实体器官移植受体中EBV相关的淋巴增生性疾病是很成功的预防和治疗方法。这些出现在免疫系统受损的受体中的淋巴瘤,产生高免疫反应,表达所有的潜伏EBV抗原(潜伏类型Ⅲ),包括免疫显性的EBV核抗原(EBNA)-3A,-3B,-3C,这些潜伏EBV抗原是免疫治疗的理想靶标。与此不同,NPC仅表达有限的产生低免疫反应的病毒抗原(潜伏类型Ⅱ),即EBNA—1,LMP-1和LMP-2。EBNA-1在NPC中有规律的表达,但它在HLAⅠ类路径的处理中被甘氨酸-丙氨酸重复序列阻断,因此它不大可能是CD8+T细胞效应物的靶标,而是CD4+T细胞的主要靶标。LMP-1和LMP-2在至少50％NPC中可检测到,它们都是CD8+T细胞的靶标。健康病毒携带者的响应检测表明LMP—1是弱免疫原性的。因此,基于CD8+CTL治疗NPC的最可能的靶标抗原是LMP-2。
　　 第一个用过继性T细胞治疗NPC的研究报道于2001年。此研究在实验室完成自体EBV-转化B-LCL(类淋巴母细胞系)恢复T细胞的活性,治疗了4个晚期NPC病例。之后,有两个临床实验用自体EBV特异性CTL治疗NPC。研究表明,自体EBV特异性CTL是安全的,诱导LMP-2特异性免疫反应,与实际反应和晚期NPC的疾病控制关联。但是,在这些研究中,EBV特异性的CTL细胞株是通过刺激EBV-LCL产生的,它是由对免疫显性的EBNA-3的CTL增生响应而形成的。抗肿瘤响应可进一步增强的策略是提高CTL细胞株对在NPC中表达的EBV潜伏类型Ⅱ抗原的特异性。
　　 怎样提高NPC免疫治疗的成功率?有研究认为,注射入病人体内的CTL在活体中扩展有限,因此提高注射产品中LMP-1和LMP-2特异性T细胞数目的策略可能是有价值的方法之一。上述方法产生的CTL细胞株对LMP2的特异性不足10％。
　　 在临床实践中,通常采取分次静脉注射CTL细胞的策略,但是难以对不同的治疗间隔和加入CTL数量与疗效之间的关系进行实验研究。本研究目的是建立数学模型,研究不同的治疗间隔和加入CTL数量与治疗效果的关系,并预测CTL细胞株对LMP2的特异性从10％上升为20％时治疗效果的变化。
　　 基于代理因子的建模(Agent-based modeling,ABM)是为由自治的、相互作用的代理因子组成的系统建模的方法。有学者主张,ABM是归纳和演绎之外的第三种科研方法。计算技术的进步使ABM在多个领域得到了广泛的应用。
　　 长期以来,ABM在社会科学中得到了应用,近年来,开始用于解决生态学和更广泛的生物医学中的问题,其中癌症生物学是ABM在生物医学研究中应用较多的领域之一。肿瘤发生是最好的例子,它是依赖于多个细胞类型(包括异常和正常的细胞)和非典型基因表达的新生组织模式现象。ABM最适合仿真这些相互作用。
　　 ABM肿瘤模型有助其在计算癌症生物学中传播的几个明显优点。(1)ABM具有再现自然的形式。因为这个特性,癌症细胞的生物学属性和行为可以用ABM很好地定义。这增强了模型的生物学实用性。(2)ABM可以模拟并允许分析生物系统的突显特性,如癌症。(3)ABM的灵活性,使它可用在多维空间。换句话说,它是可扩展的,这对在临床的应用是非常重要的。
　　 根据文献报道的实验室研究成果:LMP1可使鼻咽癌EGFR的表达上调12倍,本研究利用ABM模型仿真了EGFR上调12倍对肿瘤生长和调控网络的影响。传统生物学方法不能区分肿瘤组织内部和表面的分子成分,也不能全程记录分子成分的变化,在本研究中仿真记录了肿瘤组织内部和表面的细胞中四种分子成分的变化趋势。
　　 本文提出的ABM模型由C.Athale等提出的肿瘤生长模型和Virginia AFolcik等提出的BIS(基础免疫系统)模型组合修改而成。在Repast S平台上,按照BIS模型的基本架构,构建3个二维空间,即区域1、区域2和区域3。区域1代表一般的实质组织,在这里,实质细胞由肿瘤细胞(TumorAgent)代替。区域2是淋巴结或脾的抽象表达,淋巴细胞在这里停留和增殖。区域3是淋巴和血液循环的抽象表达,是免疫系统细胞传播的管道。各区域之间通过特殊的代理因子—入口(PortalAgent)相互联通。免疫治疗是通过静脉注射CTL细胞株实现的,仿真是通过向区域3加入CTL代理因子实现的。
　　 在肿瘤生长模型中,有两个重要的JAVA类,TumorModel.java和TumorAgent.Java。在模型运行时,TumorModel.java产生一个对象,用于控制模型的运行,规定模型的参数和模型每一次迭代的动作,主要是营养扩散、判断肿瘤细胞因子应该进入哪种状态并执行这个动作；而TumorAgent.java在前者的控制下产生多个对象,即肿瘤细胞,它规定肿瘤细胞代理因子的参数和每次迭代时的动作。还有其它的JAVA类完成辅助功能。
　　 在BIS模型中,控制模型运行的类是ImmuneModel.java。把这两个模型组合在一起的方法是:把ImmuneModel.java的功能模块,如初始化、每次迭代的行为规则等,分别嵌入在TumorModel.java中相应的位置。
　　 TumorAgent不仅完成肿瘤细胞生长的功能,还要完成BIS模型中实质细胞的功能。对它的处理,与把TumorModel和ImmuneModel融合的方法类似。对于被病毒感染的实质细胞,其命运是被BIS中的免疫系统杀死。但是,在这里,TumorAgent同时还是肿瘤细胞,所以调高了它被免疫细胞杀死的阈值。
　　 仿真使用的计算机CPU为AMD Athlon64位双核处理器,主频2.20GHz,内存2G。完成一次仿真约需720秒。
　　 在仿真中,治疗由两次向区域3加入CTL代理因子组成,第1次在tick=200时,第2次在tick=206到254,间隔为6个时间步长。这样,对于10％的CTL对LMP2特异性的情况,有9种不同的治疗方法。对每种治疗方法,共进行10次仿真。
　　 另外,加入CTL的仿真时间固定为200和242,改变CTL的加入数量,从1000到2600,步长200。对每种治疗方法,同样进行10次仿真。
　　 对于20％的CTL对LMP2特异性的情况,重复上述仿真过程。
　　 每次仿真,记录在tick=200和350时的TumorAgent总数,并将后者除以前者,作为TumorAgent的增长率k加以记录,k反应了治疗的效果。
　　 EGFR信号转导网络在器官发育、上皮发生、细胞生长调控、肿瘤发生以及血管形成等过程中均起着非常重要的作用。EGFR的突变、过度表达、结构重排或正常调控功能的丧失都会引起细胞生长和分化的异常。王树森等报道鼻咽癌组织中EGFR表达的阳性率达到70.9％,EGFR阳性的患者的总生存期(OS)、疾病进展时间(TTP)显著低于阴性患者。袁太泽等发现pEGFR(EGFR的磷酸化形式)高表达与鼻咽癌患者的无转移生存相关,pEGFR高表达患者五年无转移生存率显著低于pEGFR低表达患者,EGFR活化可能与鼻咽癌转移有关。Magkou,C.等发现,在侵润型乳腺癌中pEGFR的表达与其血管生成和侵润有关,EGFR/pEGFR表型与病人生存质量差相关。本研究发现,在加入CTL的仿真过程中,位于肿瘤组织表面和内部的EGFR_s(细胞膜上的EGFR)有明显的上升过程,而细胞膜内有活性的EGFR磷酸化形式phos_TGFaEGFR_s(即pEGFR)有明显的下降过程,说明在进行CTL免疫治疗时,肿瘤生长受到抑制,EGFR的活性下降,这与上述的研究成果是一致的。EGFR_s和phos_TGFaEGFR_s可相互转化,后者下降自然伴随前者上升。
　　 本仿真对进一步的临床实验研究有一定的指导意义,这也包括如下量化结果:
　　 (1)CTL加入时间间隔与治疗效果的关系:依据10％的CTL对LMP2特异性折线,当tick2从206到230时,增长率k从最小值开始上升到最大值；之后,k下降,在tick2=242或248时,达到局部最小值；tick2=254时,k又开始上升。而据20％的CTL对LMP2特异性折线,增长率k总体上比前者低,变化趋势与前者相仿；在tick2=230时,k为局部最大值；在tick2=242时,k为全局最小值,这意味着这时可能取得最好的疗效。从这两条曲线看,tick2=242时,都取得最好的治疗效果。这里,1个仿真时间代表肿瘤细胞1次增殖的时间。这意味着,在其它条件不变的情况下,对于10％和20％的CTL对LMP2特异性,在加入CTL的间隔为肿瘤细胞1次增殖的时间的42倍时,取得最好的治疗效果。
　　 (2)CTL加入数量与治疗效果的关系:在增加CTL数量的过程中,对于10％和20％的CTL对LMP2是特异性的两种情况,增长率k下降的趋势相近。CTL数量从1000上升为1800,k下降较快,约下降42.6％。而CTL数量从1800上升为2600,k下降较慢,约下降30.9％。这提示,增加CTL数量可以改善治疗效果,但是CTL数量增加到某种程度后,增加相同量的CTL得到的改善程度明显下降。
　　 本课题在深入研究EB病毒与鼻咽癌的关系的基础上,首次将ABM建模应用于鼻咽癌治疗的研究领域,并获得了如下成果:
　　 1.建立了基于ABM的肿瘤生长和人体免疫系统的组合模型,此模型可在多尺度(分子、细胞、组织)对肿瘤生长及其与人体免疫系统的相互作用进行仿真。模型具有良好的扩展性和方便易用的仿真界面。
　　 2.根据文献报道的实验室研究成果:LMP1可使鼻咽癌EGFR的表达上调12倍,利用ABM模型仿真对比了EGFR正常表达和上调12倍对肿瘤生长和调控网络的影响,记录了肿瘤组织内部和表面细胞中四种分子成分的变化趋势。
　　 3.针对鼻咽癌的细胞毒性T细胞免疫治疗的文献报道,利用ABM模型研究了不同的治疗间隔和加入CTL数量与治疗效果的关系,并预测了CTL细胞株对LMP2的特异性从10％上升为20％时治疗效果的变化。
　　 本文所构建的基于代理因子建模(ABM)的方法所获得的鼻咽癌的细胞毒性T细胞免疫治疗的定量研究模型是开放式的仿真模型,其相关研究成果对开展进一步实验验证研究有一定的指导意义,同时把未来相关实验研究的数据不断地加入到本模型中来改进完善模型,可望得到更加准确、可靠和更加丰富的仿真预测结果。在本模型研究中用到的仿真因子,无论是肿瘤细胞代理因子TumorAgent,还是免疫系统BIS中的免疫细胞,数量还比较少,TumorAgent最多达到3000多个,与真实的情况相比尚有较大差距。另外,仿真在二维平面的环境中进行,进一步的研究将考虑在三维环境中实现。