乳腺癌EphA2，EphrinA1，ERα，ERβ和PR的表达及RNAi沉默EphA2基因的实验研究

摘要

乳腺癌是严重危害人类生命健康的常见恶性肿瘤之一,已位居女性肿瘤死亡首位,全球每年约有120余万妇女患乳腺癌,约50万妇女死于乳腺癌。其发病率和死亡率在世界范围内呈较快增长趋势,每年约以0.2～0.3％的速度递增,且发病年龄趋向年轻化；已经证实,年龄、疾病分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况和肿瘤微血管密度等临床病理学因素与肿瘤预后密切相关,且早期远处转移和复发是肿瘤致死的主要因为。因此,迫切需要寻找一个敏感、能早期预测乳腺癌复发转移的分子生物学标志物及抑制其复发转移的基因治疗靶点,为临床对乳腺癌的复发和转移的早期预测提供一定的参考依据。
　　 乳腺癌的发生、发展与人体内雌激素的增加、孕激素的减少密切相关,性激素的代谢素紊乱促进了某些乳腺癌的生长,但其确切发病机制目前尚不清楚。新近在对乳腺癌细胞中EphA2表达状况的研究中,越来越多的证据表明EphA2与ER之间存在相互影响。但是对于EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR在乳腺癌中的联合检测,国内外少见报道。
　　 新辅助化疗是对非转移性肿瘤局部治疗之前进行的全身性、系统性细胞毒性药物治疗。目前新辅助化疗已成为局部晚期乳腺癌的标准治疗。国际上关于乳腺癌新辅助化疗的多中心随机临床实验结果显示:新辅助化疗与辅助化疗同样有效。对新辅助化疗敏感的乳腺痛比不敏感者预后好,特别是在局部进展期乳腺癌的应用中已取得良好的效果。新辅助化疗后许多病理学和生物学指标都发生了改变,很多基因表达均发生了改变。寻找出能够预测新辅助化疗疗效并帮助选择内分泌治疗、化疗方案、判断乳腺癌预后的肿瘤分子标记物已经成为目前研究的热点之一,对于EphA2及ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达的研究,国内外少见报道。
　　 我们通过免疫组织化学技术联合检测了EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR的蛋白在乳腺癌中的表达及各自与临床病理学因素的关系；采用免疫组织化学技术检测EphA2和ER、PR在新辅助化疗前后的乳腺癌组织中的表达情况；用RT-PCR技术研究了EphA2及其配体EphrinA1各自的mRNA在乳腺癌中的表达及各自与临床病理学因素的关系；应用逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制EphA2在MCF-7细胞中的表达,以期寻找出能帮助选择有效治疗方案及预测乳腺癌预后的有效指标,并探讨EphA2在乳腺癌中的作用机制及预后价值,以期为乳腺癌的基因治疗提供新的思路。本研究分为四章:
　　 第一章 乳腺癌中EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR蛋白的表达及其意义
　　 目的
　　 研究EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR等的蛋白在乳腺癌中的表达及其意义。
　　 方法
　　 1.用免疫组织化学SP法检测130例乳腺痛组织中EphA2,EphrinA1,ERα,ERβ及PR等各自蛋白的表达水平及其与临床病理因素的关系。
　　 2.统计学处理:用spss13.0 for windows统计软件包对所有资料进行统计学处理。采用卡方检验(chi-square),t(studert t)检验,方差分析(ANVOA),相关性检验等。显著性标准为P<0.05。
　　 结论
　　 1.在乳腺癌组织中检测到EphA2、EphrinA1、ERα、ERβ和PR的蛋白的表达,提示他们可能与乳腺癌的发生发展有关。
　　 2.EphA2蛋白在乳腺癌的表达与临床分期、淋巴结转移和组织学分级显著相关,EphrinA1蛋白在乳腺癌的表达与临床分期、组织学分级显著相关,ERβ蛋白在乳腺癌的表达与组织学分级相关,提示其潜在的预后价值并有可能成为乳腺癌预后评估的肿瘤标志物。EphA2蛋白高表达与乳腺癌淋巴结转移有关,提示其可能参与乳腺癌的转移机制。
　　 3.EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的蛋白表达分布的一致性提示在乳腺癌中,EphrinA1是EphA2受体的主要配体之一,二者可能在乳腺癌细胞信号传导过程中协调发挥作用。EphA2和EphrinA1共同定位于肿瘤细胞和乳腺癌的血管内皮细胞,提示二者可能协同参与了乳腺癌的血管生成,二者有望成为乳腺癌基因治疗的新靶向。
　　 4.乳腺癌组织中有较高的ERα蛋白和ERβ蛋白阳性表达,提示乳腺癌是性激素依赖性肿瘤,可根据受体的含量指导临床进行内分泌治疗。
　　 5.乳腺癌细胞EphA2与EphrinA1的表达显著相关,提示EphrinA1的表达受EphA2诱导,EphrinA1可以通过自分泌和/或旁分泌环作用于相应的EphA2受体促进癌细胞增殖及血管形成。
　　 6.在乳腺癌中,EphA2蛋白的表达与ERα蛋白负相关,和ERβ蛋白正相关相关,提示ERα可能副性调控EphA2的表达,而ERβ可能正性调控EphA2的表达。
　　 7.EphA2和EphrinA1的检测可作为乳腺癌预后的评估指标。
　　 第二章 EphA2、ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达及意义
　　 目的
　　 研究乳腺痛中ER、PR 和EphA2的表达在新辅助化疗前后的变化及临床意义。
　　 方法
　　 采用免疫组化SP法检测ER、PR和EphA2在52例新辅助化疗前后的乳腺癌组织中的表达情况。
　　 结论
　　 新辅助化疗能抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,显著降低EphA2的阳性表达,而对ER、PR的表达无显著影响。
　　 第三章 乳腺癌中EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA的表达及其意义
　　 目的
　　 研究EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA在乳腺癌中的表达及其意义。
　　 方法
　　 1.选择40例乳腺癌冰冻标本,分别经免疫组化证实有不同级别的EphA2蛋白表达和EphrinA1蛋白表达,用于RNA提取。
　　 2.应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测其中EphA2mRNA和EphrinA1mRNA的表达,比较各自mRNA与其蛋白表达的相关性及与临床病理因素的关系。
　　 3.统计学处理:所有数据均经应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。应用t检验(t-test)；方差分析(One-Way ANVOA)；非参数检验(Kruskal-Wallis test法)；显著性标准为P<0.05。
　　 结论
　　 1.乳腺癌癌组织中EphA2 mRNA的表达与组织学分级、淋巴结转移及临床分期均显著相关(P=0.000)；EphrinA1 mRNA的表达与组织学分级、淋巴结转移及临床分期相关(P=0.000)；提示EphA2 mRNA的阳性表达和EphrinA 1 mRNA的阳性表达均与乳腺癌的恶性行为相关,有可能成为乳腺癌预后的标记物。
　　 2.EphA2mRNA、EphrinA1mRNA的阳性表达与各自蛋白质的表达具有一定的相关性,提示乳腺癌组织中二者主要在转录水平调节。
　　 3.EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA表达水平分别与各自蛋白表达水平的不完全一致,提示二者在乳腺癌中存在某种转录后翻译水平的调控机制和蛋白质积聚或降解通路障碍。
　　 第四章 RNAi靶向沉默乳腺癌细胞系MCF-7中EphA2的表达的研究
　　 目的
　　 探讨逆转录病毒介导的RNAi对乳腺癌细胞系MCF-7中EphA2表达的影响。以期为乳腺癌的基因治疗提供新的思路和手段、
　　 方法
　　 1.根据人EphA2mRNA基因编码区序列,按照序列设计原则及网上软件,设计并合成两条互补的编码EphA2shRNA的寡核苷酸序列。
　　 2.两条互补的编码EphA2shRNA的寡核苷酸链煺火后与线性载体质粒RNAi-READY-pSIREN-RetroQ连接,构建形成重组质粒pSIREN-RetroQ-EphA2,同时用试剂盒提供的阴性对照siRNA双链寡核苷酸构建对照载体pSIREN-RetroQ-C。
　　 3.以重组质粒pSIREN-RetroQ-EphA2转化大肠杆菌。用碱裂解法少量制备质粒DNA,然后进行酶切鉴定和DNA测序分析。
　　 4.脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PA317中,并进行克隆与筛选。
　　 5.以重组质粒pSIREN-RetroQ-EphA2转染MCF-7细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定表达的克隆。
　　 6.Westen-blot检测EphA2蛋白的表达。
　　 结论
　　 1.从EphA2 mRNA序列中筛选出有效的siRNA序列,并设计了互补双链寡核苷酸发夹结构,成功构建了EphA2 siRNA的逆转录病毒表达载体,并将之转染到MCF-7细胞。
　　 2.通过逆转录病毒载体介导的RNAi,能够抑制MCF-7细胞中EphA2的蛋白表达,为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的乳腺癌细胞恶性生物学行为变化奠定了实验基础,为以EphA2为靶向的乳腺癌的基因治疗提供了新的思路和手段。

目录

文摘

英文文摘

前言

参考文献

第一章 乳腺癌中EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR蛋白的表达及意义

1.1 材料与办法

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验方泫

1.1.3 结果判定

1.1.4 统计学分析

1.2 结果

1.3 讨论

1.3.1 关于EphA2和 EphrinA1

1.3.2 关于ERα、ERβ和PR

1.3.3 EphA2和EphrinAl在乳腺癌中的表达

1.3.4 ERα、ERβ和PR在乳腺癌中的表达

1.3.5 EphA2和EphrinA1表达与临床病理因素的关系

1.3.6 ERα、ERβ、PR在乳腺癌中的表达与临床病理因素的关系

1.3.7 EphA2与EphrinA1在乳腺癌中表达的相关性

1.3.8 EphA2与ERα、ERβ及PR在乳腺癌中表达的相关性

1.4 结论

1.5 图片

参考文献

第二章 EphA2、ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达及意义

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 结果判定

2.1.4 统计学分析

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 结论

2.5 图片

参考文献

第三章 EphA2mRNA和EphrinA1 mRNA在乳腺癌中的表达

3.1 材料和方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 统计学分析

3.2 结果

3.2.1 EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA电泳结果

3.2.2 EphA2 mRNA表达与临床病理因素的关系

3.2.3 EDhrinA1 mRNA表达与临床病理因素的关系

3.2.4 EphA2 mRNA表达及与蛋白表达的关系

3.2.5 EphrinA1 mRNA表达及EphrinA1蛋白表达的关系

3.3 讨论

3.4 结论

参考义献

第四章 RNA干扰靶向沉默乳腺癌细胞系MCF-7中EphA2的表达的研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果

4.2.1 pSIREN-RetroQ-EphA2重组质粒的酶切鉴定

4.2.2 pSIREN-RetroQ-EphA2重组质粒测序

4.2.3 基因转染对MCF-7细胞中EphA2蛋白表达的影响

4.3 讨论

4.4 结论

参考文献

全文小结

综述

参考文献

附录一 中英文缩略词对照表

附录二 乳腺癌组织学分级标准

附录三 乳腺癌的TNM分期标准

攻读博士学位期间成果

致谢

统计学审稿证明