生理剂量睾酮延缓雄性小鼠心肌细胞衰老:非雄激素受体介导的途径

摘要

人口老龄化是上个世纪末到本世纪初出现的一个世界性问题。目前世界老龄人口,即60岁及以上的人口达6.5亿。到2050年,预计老龄化人口将达到20亿,且80％的老年人将生活在发展中国家。我国到2010年,60岁以上老年人口已有1.74亿,占全国总人口的12.78％;预计到2015年和2020年,这一比例将分别达到15％和18％。因此倡导健康老龄化,促进老龄人口的健康是卫生提供者和社会的使命。理论上抗衰老治疗可以改变衰老引起的生化和分子学方面的变化,纠正衰老相关的生理学变化,减少对衰老相关疾病的易感性。美国抗衰老医学学会(A4M)声称:“衰老相关的能力丧失由机体的生理功能障碍引起,许多情况下这些功能障碍可被内科治疗所改善。人类的寿命可望延长,老年人的生活质量可望改善”。
　　 我国与发达国家的心力衰竭患者数量都在不断增加,发病率和患病率也在逐步上升,其重要原因之一就是社会人口老龄化,随着年龄的增长心力衰竭患病率升高。欧洲心脏病学会统计发现,在普通人群中心力衰竭的总患病率约为2％-3％,而在70-80岁的老年人群中,则高达10％-20％。以往一直认为年龄属于不可改变的因素,因而研究相对较少。但对传统心力衰竭危险因素的分析不能完全解释其发生易感性和进展速度易变性的特点。随着年龄的增长,心力衰竭的易感性和进展速度均增加,其原因是心脏随增龄发生了衰老变化。故年龄是心力衰竭发生和发展的重要危险因素之一。因此,在日益人口老龄化的今天,研究心脏衰老可能对心力衰竭的防治具有重要的临床意义。
　　 机体内环境失衡可引起细胞生存和器官功能障碍,加速衰老进程。在增龄性变化的机制中也涉及到了性激素平衡的改变。睾酮是男性体内最重要的雄激素,调节着靶器官的生长发育与衰老过程。睾酮可通过与靶组织细胞内特异性雄激素受体(Aaadrogen receptor,AR)结合而发挥其生理作用。另外也可通过芳香化酶转化为雌二醇而与雌激素受体(Estrogen receptor,ER)结合,产生生物学效应。心脏是雄激素作用的靶器官,睾酮可通过与心肌细胞内AR或ER结合对心脏起直接调节作用。男性50岁后体内总睾酮及生物活性睾酮水平显著降低,与此同时雄激素靶器官的结构和功能随之发生显著变化。老年男性血清睾酮水平与多种增龄相关性疾病发病率呈负相关。与衰老相关的许多症状和体征,如性功能障碍、内脏性肥胖、骨骼和肌肉强度减弱及情绪障碍等均与雄激素缺乏的年轻男性患者相似。睾酮可促进细胞生长、增殖,同时具有抗凋亡、抗炎症前细胞因子及抑制氧化应激等作用。已有研究发现睾酮缺乏与衰老相关的心血管疾病危险因素和部分心血管疾病相关,如:代谢综合征、胰岛素抵抗、2型糖尿病、冠心病及心力衰竭等。这些结果提示雄激素缺乏与男性个体衰老之间可能存在着内在的联系。Palm Springs预期寿命协会声称:“通过补充体内激素至年轻人水平有助于避免衰老相关的疾病,逆转生物学年龄,延长预期寿命及有效改善生活质量”。睾酮替代治疗雄激素缺乏患者已被普遍接受,睾酮治疗可改善老年及去势C57BL/6鼠的脑衰老(认知功能)。睾酮治疗已作为治疗心力衰竭的可选择措施之一,可使心室肌细胞的最大收缩峰值增加,还能增加心肌细胞的舒张速率。但睾酮替代治疗纠正心力衰竭是否通过延缓心脏衰老本身,尚未见相关的文献报道。那么,雄激素缺乏能否引起心脏衰老?睾酮替代治疗能否延缓心脏衰老?对这些方面的研究可能为改善或延缓心力衰竭的发生提供重要的思路。
　　 心脏衰老是心脏随增龄发生的结构和功能异常的变化。心脏衰老的结构异常表现为心室重量减少和左室壁厚度增加；心肌内胶原数量增加,其物理特性也发生改变,致僵硬度增加。心脏衰老的功能异常表现可总结为心脏储备能力降低以及对负荷的适应力下降。具体表现为左室收缩和舒张功能随增龄而下降,而以舒张功能下降为主,左室舒张早期充盈率80岁时平均下降50％；最大心率下降,从20岁到85岁最大心率减少约30％；心输出量峰值下降,心指数储备下降；对儿茶酚胺的反应性降低,对肾上腺素能受体刺激的反应降低,对压力感受器和化学感受器的反应性下降等。这些都是被广泛报道的衰老引起的心脏损害。这些变化改变了心脏疾病发生的阈值、严重程度和预后。作为心脏功能和收缩单元核心组成的心肌细胞,也是心脏衰老研究的核心。心肌细胞衰老时细胞总体数量持续减少,剩余细胞代偿性肥大,肌浆网钙泵ATP酶活性下降,收缩蛋白表达量及类型发生改变,细胞内氧化酶及抗氧化酶活性发生改变等,这一系列的变化被认为可导致心脏功能下降及心脏疾病发生增加。因此,干预心肌细胞的衰老可能改善心脏功能、延缓心脏疾病发生和发展。
　　 对心肌细胞衰老的研究也是围绕衰老机制展开的。目前有关衰老机制的学说有数十多种,总体来说最终归结为两大类型:一类是以自由基、糖基化、激素紊乱等损害为代表的环境伤害衰老理论,认为衰老是环境因素对细胞进行性和累积性毁坏的结果；另一类是以端粒缩短、衰老基因、细胞周期调控因子等为代表的遗传因子程序化衰老理论,认为衰老是机体有序的基因活动,是通过遗传按程序预先安排好的,或为特异的“衰老”基因所表达,或为可用基因的最终耗竭。这两大类理论从不同角度阐述了机体衰老的可能机制,使衰老的研究不断向细胞、分子和基因水平深入。由于衰老是一个复杂的过程,环境与遗传因素都影响着衰老的过程,因此当今有关衰老的研究已经逐步走进了将这两种理论进行合作的时代,并将发掘衰老的机制和延缓衰老的努力集中在一个相对明确的范围之内,即集中在环境因子伤害造成的增龄性衰老改变的相关范围之内。引起心肌细胞衰老的原因也可归纳为以上2个方面的损伤因素,即外源性因素和内源性因素。外源性因素或环境因素可影响内源性因素,共同作用最终决定心肌细胞衰老发生的步伐。
　　 基于上述这些观点,我们假设雄激素缺乏这一外源性环境因素可引起心肌细胞衰老,睾酮替代治疗可延缓衰老的发生；而雄激素缺乏与睾酮治疗对心肌细胞衰老的影响也是通过衰老机制中的外源性及内源性途径共同作用的结果。本研究用去势雄鼠和睾丸女性化(Testicular feminized,Tfm)小鼠作为雄激素缺乏模型。Tfm小鼠呈现AR编码基因的X染色体连锁的单碱基对缺失。这一缺失引起AR mRNA移码突变,导致AR提前终止。故Tfm鼠表现为无功能的AR,同时先天的睾酮缺乏(仅为同窝对照鼠的1/10)。Tfm鼠可作为研究雄激素缺乏和外源性睾酮作用途径的良好实验模型。因此,本研究围绕以下两个方面进行,不但可以回答上述提出的假设问题,同时由于Tfm鼠表达无功能的AR,可以探讨睾酮对心肌细胞的作用是否通过其经典的AR途径。
　　 一、雄激素缺乏诱导小鼠心肌细胞衰老及生理剂量睾酮(Testosteronepropionate,T)的干预作用
　　 本研究以目前公认的衰老标志物:衰老相关β-半乳糖苷酶(Age-associatedβ-galactosidase,SAβ—gal)活性和细胞的相对端粒长度为主要观察指标,首先对雄激素缺乏诱导心肌细胞衰老的可能性进行了实验观察。β-半乳糖苷酶活性采用免疫细胞化学染色方法,心肌细胞相对端粒长度采用Real-time定量PCR法测定。实验分4组:正常组(24周龄C57BL/6J雄鼠,n=8),去势组(8周龄C57BL/6J雄鼠去势后正常饲养到24周,n=8),Tfm组(24周龄Tfm小鼠,n=7),去势+T组(8周龄C57BL/6J雄鼠去势后正常饲养4周,肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睾酮3个月,n=8)。取左心室心肌组织分离心肌细胞后,测定上述指标。结果显示:与正常组相比,去势组和Tfm组心肌细胞SAβ-gal蓝染阳性面积平均光密度(Integrated optical density,IOD)值均明显增加(P=0.000和P=0.000),而两组蓝染阳性面积IOD值相比无统计学差异(P=0.108)；去势组和Tfm组心肌细胞相对端粒长度均明显缩短(P=0.000和P=0.000),而两组相比无统计学差异(P=0.366)。这提示雄激素缺乏小鼠心肌细胞发生了衰老。
　　 此外,睾酮干预对心肌细胞衰老研究的结果显示:与去势组相比,给予生理剂量睾酮治疗使心肌细胞SAβ-gal蓝染阳性面积IOD值明显降低(P=0.000),相对端粒长度明显延长(P=0.002)。提示生理剂量睾酮治疗可延缓心肌细胞衰老的发生。
　　 二、雄激素缺乏小鼠心肌细胞衰老及生理剂量睾酮(T)干预的机制
　　 为了进一步探讨雄激素缺乏及生理剂量睾酮对心肌细胞衰老影响的途径及作用机制,我们观察了生理剂量睾酮治疗与未治疗的小鼠心肌细胞各衰老相关指标的变化,及AR缺乏对睾酮治疗的影响。实验分5组:正常组(24周龄C57BL/6J雄鼠,n=8),去势组(8周龄C57BL/6J雄鼠去势后正常饲养到24周,n=8),Tfm组(24周龄Tfm小鼠,n=7),去势+T组(8周龄C57BL/6J雄鼠去势后正常饲养4周,肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睾酮3个月,n=8),Tfm+T组(12周龄Tfm小鼠肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睾酮3个月,n=8)。取左心室心肌组织分离心肌细胞后,比色法测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,巢式PCR法测定心肌细胞线粒体DNA突变率,Real-time定量PCR法测定心肌细胞相对端粒长度,Western-blot法检测心肌细胞周期调控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表达。结果显示:(1)与正常组相比,去势组和Tfm组SOD活性下降(P=0.011和P=0.028)；MDA含量升高(P=0.001和P=0.000)；线粒体DNA突变率增高(P=0.000和P=0.000)；相对端粒长度缩短(P=0.000和P=0.000)；周期调控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表达量均显著升高(p16INK4a:P=0.035和P=0.005；Rb:P=0.000和P=0.000；p53:P=0.000和P=0.000)。而两实验组上述指标相比无统计学差异。(2)与去势组相比,去势+T组SOD活性增高(P=0.000)；MDA含量降低(P=0.000)；线粒体DNA突变率减低(P=0.008)；相对端粒长度延长(P=0.001)；周期调控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表达量均下调(p16INK4a:P=0.024；Rb:P=0.000；p53:P=0.000)。(3)与Tfm组相比,Tfm+T组SOD活性增高(P=0.038)；MDA含量降低(P=0.001)；线粒体DNA突变率减低(P=0.000)；相对端粒长度延长(P=0.000)；周期调控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表达量均下调(p16INK4a:P=0.002；Rb:P=0.000;p53:P=0.000)。(4)去势+T组与Tfm+T组相比,上述各指标均无统计学差异。由于Tfm鼠表达无功能的AR,通过对其与去势小鼠睾酮治疗后衰老相关指标的比较,提示生理剂量睾酮通过非经典AR依赖的机制延缓心肌细胞衰老。
　　 结论:
　　 通过本研究,我们能够得出以下结论:
　　 1.雄激素缺乏小鼠(去势和Tfm小鼠)的心肌细胞出现衰老的细胞特征,提示雄激素缺乏可引起心肌细胞衰老。雄激素缺乏可通过增加细胞内氧化应激,增加线粒体DNA突变率,缩短相对端粒长度和上调细胞周期调控因子p16INK4a、去磷酸化Rb及p53蛋白的表达等途径使心肌细胞发生衰老。
　　 2.生理剂量睾酮(3.13mg/kg/72h)干预可延缓小鼠心肌细胞的衰老。生理剂量睾酮对心肌细胞衰老的干预作用部分是通过减少细胞内氧化应激,降低线粒体DNA突变率,保护相对端粒长度和下调p16INK4a、去磷酸化Rb及p53蛋白表达水平来实现的。
　　 3.生理剂量睾酮通过非AR依赖的机制延缓心肌细胞衰老。