中国流行HIV-1对抗病毒药物的敏感性及病毒基因多态性研究

摘要

目的与意义:目前国际上将HIV-1分为M组、N组和O组三个组,M组又包括9种亚型和49种重组流行株(Circulating Recombinant Forms,CRFs),而且HIv的流行重组型还在不断增多。中国是一个HIV流行形势复杂的国家,包括B、B'(Thai-B)、C、F、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF02_AG等多种HIV亚型和重组型,而且这些亚型或重组型毒株之间再重组导致产生了01B、01C和CRF0708等毒株。HIV-1 CRF07_BC、CRF01_AE和B'亚型是我国HIV—1主要流行的三种亚型毒株,大多感染这三种亚型的艾滋病患者分别通过静脉吸毒,性传播途径和既往静脉献血而感染艾滋病。
　　 高效联合抗逆转录病毒治疗(Highly Active Antiretrovival Therapy,HAART)是目前最有效的抗HIV治疗方法。HIV/AIDS病人在有效的抗病毒治疗下,其平均生存期能延长数十年,艾滋病已成为一种像高血压、糖尿病这些不能根治但可以长期控制的慢性疾病。但HAART不能彻底清除感染者体内的艾滋病病毒,需终身用药,由此而带来的药物不良反应,依从性,病毒耐药性产生,耐药病毒株的传播以及经济负担等问题,成为了HAART面临的主要问题和抗病毒治疗失败的主要原因。我国的HAART开始于1999年底,但较多病人接受治疗始于2002年底,而且主要是基于国家免费治疗药物。到目前为止,全国已有10万多HIV/AIDS病人接受了HAART。尽管我国所用的药物多以国产仿制药为主,但与抗病毒治疗前相比,艾滋病患者的病死率已明显下降。
　　 我国抗病毒治疗药物组方,多为一种或两种核苷类逆转录酶抑制剂和一种非核苷类逆转录酶抑制剂的联合应用,如Zidovudine+Didanosine+Nevirapine,Stavudine+Lamivudine+Nevirapine和Lamivudine+Zidovudine+Nevirapine的组合。自2003年我国实行免费抗病毒治疗以来,已有大量关于耐药基因的产生而导致抗病毒治疗失败的报道。研究发现抗病毒治疗失败的病人经病毒基因型耐药监测发现至少有一个或更多对逆转录酶抑制剂耐药相关点耐药位点和交叉耐药情况,且表型耐药情况的结果与基因型耐药有较高的一致性。
　　 本文通过进一步研究不同亚型HIV-1临床株对药物的敏感性与病毒基因天然存在的多态性的关系,可以从基因水平阐明毒株逃逸药物压力而产生药物耐受和适应性机制。迄今,我国从未有过关于临床分离株对HIV-1进入抑制剂和蛋白酶抑制剂的基线敏感性的报道。作为优化抗病毒组方,提高抗病毒治疗效果的潜在替代药物,也很有必要对其基线敏感性及其和病毒基因存在的天然多态性的关系进行研究。本文选择分别来自新疆,北京和安徽三个不同流行地区的三种不同亚型HIV-1毒株,进行其对进入抑制剂,逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的基线敏感性研究及其与病毒基因多态性的关系分析。了解HIV-1临床株对抗病毒药物的基线敏感性对抗病毒药物治疗中药物的正确选择和初始治疗时抗病毒药物的剂量选择都有重要的理论指导意义。
　　 方法和结果:本研究中HIV-1CRF07_BC和B'亚型毒株来自2003年至2005年纳入的中国区AIDS多中心研究的艾滋病感染人群,分别为新疆静脉吸毒感染者和安徽既往献血感染人群。HIV-1CRF01_AE毒株来自北京地区经性传播途径感染的患者,于2006年至2008年纳入AIDS多中心研究。本研究经医学伦理认证委员会认可(IRB00002276),在收集患者血液样本前所有纳入研究的病人均签署了知情同意书。
　　 排除经抗病毒治疗后的人群中分离出来的病毒后,仅有14株病毒纳入我们的研究,其中11例男性感染者和3例女性患者,平均年龄为37.6岁(27—52)。这14例病人通过三种不同的传播途径而感染HIV-1,其中5例为来自安徽的既往静脉献血人群(Former plamsa donors,FPDs),5例来自新疆的静脉吸毒人群(Injection drug risers,IDUs)和4个来自北京的性传播途径感染者(Sexual transmitted infections,STIs)。入选病人的平均病毒载量为5.14±0.97log拷贝/mL(4-6.2),平均CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞计数分别为415±185个/μl(75-628)和1090±419个/μl(352-1955)。
　　 将成功分离的病毒感染HIV-1阴性PBMCs后扩大培养,用表达CCR5和(或)CXCR4的GHOST细胞系(GHOST-CCR5,GHOST-CXCR4和GHOST-R5/X4)测定临床分离HIV-1病毒株的辅助受体利用情况。结果表明来自新疆的5株CRF07 BC重组病毒株和来自北京的4株CRF01_AE重组临床分离株为R5嗜性,利用CCR5辅助受体进入靶细胞；来自安徽的5株B'亚型HIV-1临床分离毒株中,3株为R5嗜性,仅利用CCR5辅助受体；另外2株(020100104、020100311)为R5/X4双细胞嗜性,能同时利用CCR5辅助受体和CXCR4辅助受体进入靶细胞。根据血浆中病毒核酸扩增的env和gag序列将HIV-1感染者分为CRF07_BC、CRF01_AE和B'亚型。从感染者PBMCs分离得到的临床分离毒株中扩增病毒得到的Gp160核苷酸序列,进行系统进化树分析再次进行亚型确认,与前面亚型分析结果一致。
　　 用药物对HIV—1病毒感染TZM-b1细胞的抑制效率来评价病毒对进入抑制剂的敏感性。首先在TZM-b1细胞上滴定病毒,以100TCID50/孔的病毒量进行药物抑制实验。在不同药物浓度下,用HIV-1感染TZM-b1细胞,通过检测化学发光值来计算药物对病毒的50％抑制效率(IC50)。三种亚型所有毒株对enfuvirtide、C34、TAK779和maraviroc都很敏感。经Student's t检验(正态分布且方差齐),或Mann-Whithney非参数检验(非正态分布或方差不齐),三种亚型分离株毒株对C34敏感性没有统计学差异,CRF07_BC亚型毒株CRF01 AE或B'亚型毒株对enfuvirtide的敏感性,B'亚型毒株与CRF07_BC亚型毒株或CRF01_AE亚型毒株对TAK779和maraviroc有显著的统计学差异(P<0.05)。同一亚型不同毒株对同一种药物的敏感性有一定的差异,可能与病毒滴定及药物敏感性检测实验过程中的随机误差,同一亚型不同毒株的基因分化及病毒的基因多态性,和实验样本量相对较少有关系。但是辅助受体CXCR4拮抗剂剂AMD3100在5μM的浓度下对所有实验的毒株均无抑制活性,包括2株双嗜性毒株(X4/R5)在内,提示我们研究的2株双嗜性毒株以利用CCR5为主。
　　 从病毒培养上清中提取病毒RNA,扩增其HIV-1包膜蛋白Gp120和Gp41核苷酸序列,与参考株HXB2相应的序列进行对比,对病毒天然存在的与进入抑制剂敏感性相关的多态性位点进行了分析。所有的毒株在NHR GIV区域均无enfuvirtide相关耐药位点出现,在553氨基酸位点所有的重组病毒株均为N553S,在大部分B'亚型毒株上为N553R。所研究的14例毒株在580氨基酸位点的Ⅰ均被Ⅴ所替代。仅在CRF07 BC毒株上发现A578T和V5831这两个多态性位点。T20为衍生于CHR区域(638-673)的多肽,我们发现在这段区域内,存在较多的多态性位点640、641、643、644、646和658,且氨基酸替换形式较复杂,如S640N/D/R/K、L641T/Q/K/E/V和S644R/M/W/E/D等。CRF07_BC亚型毒株Gp120 V3区氨基酸比CRF01_AE和B'亚型毒株变异性更大。多态性位点R306S、R311I、R315Q、V318Y、T319A、I320T、K323I、N326D和M317I在大部分CRF07_BC分离株中出现,而N300S和K305T仅在所有CRF01_AE毒株中存在。在所有CRF07_BC和CRF01_AE重组毒株中发现的R315Q、A316TN和T319A,也可能是与辅助受体抑制剂敏感性相关的多态性位点。
　　 糖基化修饰对Env蛋白的免疫和生物学活性很重要,我们对病毒包膜蛋白的糖基化位点也进行了分析。结果发现,HIV-1 B'亚型,CRF01_AE和CRF07_BC三种亚型Gp120蛋白糖基化位点没有明显差异性,其平均值分别为25、25.6和26.2。B'亚型毒株Gp41区域糖基化位点平均数目为5.2个,与CRF01_AE和CRF07_BC相比,具有明显的差异性(P<0.05)。
　　 本研究以假病毒系统为药物敏感性检测模型,研究了我国流行的主要HIV—1亚型毒株CRF07_BC包膜蛋白存在的天然多态性位点与病毒对进入抑制剂的敏感性的关系。CH110为来源于中国地区HIV-1流行亚型毒株CRF07_BC的env基因质粒,以此为模板,分别在Gp120和Gp41上引入突变位点:K305R、Q315E、Q315R、T316A、F317W、A319T、A319R和Q328K；V518M、T578A、1583V、Q630E、A662E和S665K。将鉴定为含目的突变基因的阳性克隆质粒与HIV-1包膜蛋白缺失的骨架质粒pSG3△env共转染,包装出假病毒颗粒。在不同药物浓度下,检测突变前后的假病毒颗粒对进入抑制剂的敏感性。结果发现,我们所设计的12个位点引入突变氨基酸后的假病毒对enfuvirtide及两个CCR5辅助受体抑制剂TAK779和maraviroc仍然具有很强的敏感性。将Gp120 V3区315位点的Q(谷氨酰胺)突变R(精氨酸)或E(谷氨酸)后,假病毒对enfuvirtide、TAK779和maraviroc的敏感性增强,尤其是Q突变成R后,对enfuvirtide的敏感性增加了约19倍。其它位点引入突变基因后,假病毒对进入抑制剂敏感性变化均不明显。
　　 逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂是我国HIV-1抗病毒治疗组方中主要两大类药物。我们将分离的病毒也进行了对RTIs和PIs基线敏感性检测。基于TZM-b1细胞的药物敏感性检测原理,Tat激活的萤光素酶蛋白表达在逆转录酶作用之后,蛋白酶作用之前,所以此体系适用于HIV逆转录酶抑制剂敏感性检测。利用传统的感染PBMC的表型检测方法进行了蛋白酶抑制剂抑制活性检测。结果显示,三种亚型HIV-1毒株对3种RTIs(ddI、NVP和TMC-125)及2种PIs(APT和RTV)都有很强的敏感性。经GraphPad Prism Software5.0软件分析结果显示,CRF07 BC和B'亚型毒株对ddI,TMC-125,APT和RTV的敏感性没有统计学差异,对NVP(P<0.05)有统计学差异。由于CRF01_AE毒株样本量相对偏少,未将其与CRF07_BC和B'亚型毒株作统计学比较。但检测的3株CRF01_AE重组毒株对非核苷类逆转录酶抑制剂NVP和TMC-125均有很强的敏感性,约是B'和CRF07_BC毒株的4-5倍,但对非肽类蛋白酶抑制剂反应性比B'和CRF07_BC毒株低。
　　 随后,本研究对扩增的HIV-1 pol基因序列也进行了分析,结果显示三种不同亚型毒株在pol基因区均无逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂相关耐药位点存在,仅在个别毒株020100968和CYM033上发现蛋白酶耐药次要相关位点A71T和L10I,020100104上存在与核苷类逆转录酶抑制剂耐药次要相关突变位点M41N,在020100096和XJDC6331上分别发现非核苷类逆转录酶抑制剂耐药次要相关突变位点V106I、E138A和E138A,但这些突变位点均未引起药物敏感性发生变化。通过对蛋白酶基因区序列分析发现,在所有CRF01_AE和CRF07_BC重组毒株中发现R41K位点,CRF07 BC重组和B'亚型共同存在L63P,193L这两个多态性位点。CRF01_AE上有一些特异性氨基酸替换:M36I、H69K和L89M。5株B哑型在RT区存在的特异性多态性位点:Q278E、Q334L、T400A和V435E。5株CRF07_BC在RT区存在多态性位点:S48T、V60I、R356K、G359T、T377M和E404D。3株CRF01_AE毒株上存在更多共同的的多态性位点:E6D、K11T、E40R、K43E、D123S、D177E、I178M、E203D、Q207A、R21S、D237R、R276K、E312T、V317T、1329V、M357K、G359S、A371V和K388R。
　　 结论:本实验结果表明中国流行的HIV-1不同亚型毒株对HIV进入抑制剂,逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的敏感性均表现出一定程度的差异,并且其中一些差异与不同亚型毒株间的基因多态性相关。此研究为感染不同亚型的HIV患者进行合理的治疗方案设计提供了重要的理论指导。并对抗病毒药物治疗中药物的正确选择和初始治疗时抗病毒药物的剂量选择都有重要的理论指导意义。