HBV-Tg小鼠原代肝细胞培养及HBV-HLA-A2.1小鼠的初步应用

摘要

背景
　　 一、乙肝感染是严重威胁人类健康的传染性疾病,并且是导致肝纤维化、肝硬化的主要原因。虽然近些年乙肝疫苗的有效接种大大降低了乙肝的发生率,但全世界仍有大约3500万的慢性感染者。因此对乙肝的发病机理、诊断、预防及治疗等研究仍需要我们大力的开展。
　　 目前乙肝研究的体外细胞模型以癌系细胞为主,如HepG2.2.15细胞。虽然其可以稳定分泌HBsAg、HBeAg、Dane颗粒,并可检测到胞内HBV-DNA等优点,但其毕竟是癌系细胞,无法表现出非癌性肝细胞的生理活性,经过长期的传代培养,其表面很重要的药物代谢酶CYP450的表达明显降低,无法很好的对一些有抗病毒效果的药物进行筛选。原代肝细胞培养为药物生物转化途径的研究、寻找药物可能的代谢物提供了一个简单和有效的模型。实践证明了原代肝细胞已经成为CYP450酶密切相关的实验模型。
　　 二、乙肝为何易慢性化及如何改变乙肝的慢性化发展是目前国内外乙肝研究的热点,也是难点。有人研究,乙肝之所以易慢性化,是由于乙肝病毒本身抗原物质可以逃避机体的特异性细胞免疫攻击而产生免疫耐受。如何能够打破乙肝患者对乙肝病毒的免疫耐受成为阻断乙肝慢性化的关键。乙肝治疗性免疫疫苗就是根据诱生机体特异性免疫应答来清除HBV病毒的原理而成为研究热点。但是由于种属间存在组织相容性抗原的差异,治疗性乙肝疫苗因为缺乏合适的动物模型,而影响对其评价。所以本实验室制备了HBV/HLA-A2.1双转基因小鼠,希望能够解决乙肝治疗性疫苗临床前研究的难题。
　　 目的
　　 一、建立HBV转基因小鼠(HBV-Tg小鼠)原代肝细胞的分离、培养方法,并观察酒精对HBV-Tg小鼠原代肝细胞的损伤敏感性和对HBsAg分泌的影响。
　　 二、观察特异性免疫多肽对HBV/HLA-A2.1双转基因小鼠(HBV/HLA-A2.1dTg小鼠)特异性免疫反应的诱导作用和对病毒学指标HBsAg、HBV-DNA的影响。
　　 方法
　　 一、采用优化改良的两步灌流法分离培养HBV-Tg小鼠与野生型Balb/c小鼠的原代肝细胞；观察细胞铺板7天内的生长状态,并检测HBV-Tg小鼠原代肝细胞培养上清的白蛋白、尿素、乳酸脱氢酶、HBsAg、HBV-DNA的分泌及表达情况；用酒精做为氧化应激损伤物质,观察对HBV-Tg小鼠与野生型Balb/c小鼠的原代肝细胞的损伤敏感性差异,并观察酒精对HBV-Tg小鼠HBsAg的影响情况。
　　 二、用乙肝特异性表位肽皮下免疫HBV-Tg、HLA-A2.1、HBV/HLA-A2.1 dTg三种转基因小鼠,一段时间后观察小鼠肝脏组织学损伤改变,脾细胞分泌IFN-γ分泌情况和脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+细胞比例。并动态观察小鼠血清HBsAg、HBV-DNA的表达情况。
　　 结果
　　 一、本实验室采用改良的两步灌注法,对乙肝转基因小鼠原代肝细胞进行培养,我们不仅能够成功分离并培养了HBV-Tg小鼠原代肝细胞,而且产量高,每只小鼠分得细胞总数达107个,经纯化后活细胞比率能达90％；用明胶提前包被的24孔板或者96孔板对其进行培养,每天观察形态学改变,第1天活细胞就基本能铺满培养板底,上层漂一些变圆、不透亮、未贴壁的死细胞。铺下去的活细胞贴壁完全,细胞呈不等大、多边形,体积变大,胞质多空泡和脂滴,细胞可见2个或2个以上细胞核,第2天有的相邻细胞靠伸长的伪足相互链接,细胞表面积更大,伸展更充分,之后几天细胞形态学改变不大,直到第7天,7d后细胞逐渐回缩,体积变小,透明度降低,培养上清更多的出现圆型、不透亮、脱落的死细胞。收集细胞每天的培养上清,检测白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶及病毒学指标HBsAg和HBV-DNA的表达情况。发现白蛋白水平在2d～5d水平最高；谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶刚开始水平较高,第2天之后就降低到一个稳定水平；病毒学指标HBsAg和HBV-DNA在铺板5d之内基本能够保持较高的水平；我们以酒精作为氧化应激损伤因素,观察酒精对HBV-Tg以及野生型Balb/c小鼠原代肝细胞的损伤敏感性差异,以及酒精对HBV-Tg小鼠原代肝细胞HBsAg的表达影响,我们发现铺板24h的原代肝细胞经不同浓度酒精(0.13％,0.5％,2％,8％)损伤16h后,检测细胞培养上清AST,两种小鼠的AST水平总体趋势是随着酒精浓度的升高,细胞释放到培养基中的AST逐渐升高。计算两组细胞的特异细胞毒性率。结果示HBV-Tg小鼠原代肝细胞在0.13％、0.5％组抑制率显著低于野生型Balb/c鼠。2％组、8％组两种细胞毒性率无明显差异。观察酒精对HBV-Tg小鼠原代肝细胞的HBsAg表达影响时发现,在酒精浓度为0.13％时,HBsAg表达水平明显高于阴性对照组,统计学有显著性差异。随着酒精浓度的增高,HBsAg的表达随之降低。在酒精浓度高于0.5％后,虽然实验组与阴性组无统计学差异,但HBsAg表达水平有低于阴性对照组趋势。
　　 二、我们制备的HBV/HLA-A2.1 dTg小鼠既能稳定地表达HBsAg、HBV-DNA等病毒学指标,淋巴细胞表面也有高水平的人源性MHC-Ⅰ(HLA-A2.1)的表达。我们用公认的CTL特异性表位肽HBcl8-27加Th特异性表位肽HBcl28-140作为实验组,OVA257-264作为OVA对照组,空白对照组不施加任何实验因素。不同组的多肽分别用非完全弗氏佐剂乳化,皮下免疫HBV-Tg、HLA-A2.1、HBV/HLA-A2.1 dTg三种转基因小鼠。经5周时间免疫后,检测发现HLA-A2.1和HBV/HLA-A2.1 dTg小鼠实验组脾细胞IFN-γ分泌量显著高于HBV-Tg小鼠和HBV/HLA-A2.1 dTg小鼠的空白、OVA对照组；HBV/HLA-A2.1 dTg小鼠实验组脾细胞CD3+/CD8+阳性细胞比率显著高于OVA对照组；做肝脏病理学HE染色发现HBV/HLA-A2.1 dTg小鼠实验组肝组织出现类似于轻度的急性炎症反应,而其他组的小鼠肝组织反应相对较轻；观察同种系小鼠经免疫后血清学HBsAg和HBV-DNA的变化,发现结果均无显著性差异。
　　 结论
　　 一、我们采用改良的两步灌流法分离的肝细胞,数量多,铺板效果好,在第2天之后,贴壁的肝细胞就基本恢复了由于胶原酶消化导致的细胞膜的部分损害。并且5d内,肝细胞保持了良好的合成白蛋白能力,铺板7d后,细胞就开始脱落,慢慢丧失正常肝细胞的功能。用酒精作为损伤影响因素,HBV-Tg小鼠原代肝细胞对酒精更敏感,更易受到损伤,并且一定浓度的酒精还会促进HBsAg的分泌和表达。这些数据同多篇国内外相关报道都基本吻合,由此证实,我们培养的HBV-Tg小鼠原代肝细胞可以用于酒精合并乙肝感染的肝损伤和酒精对乙肝病毒复制影响等方面的研究。
　　 二、我们用乙肝特异性表位肽皮下免疫HBV/HLA-A2.1 dTg小鼠,结果证实了免疫性多肽激活了双转基因小鼠体内的特异性免疫细胞,并且可能产生了对有HBV复制的肝细胞的炎症反应。但遗憾的是,在机体特异性免疫反应增高的同时,并未发现小鼠体内HBsAg和HBV-DNA的明显下降。原因可能是小鼠病毒学指标的表达个体差异性大,表达水平较低,轻微的变化不容易被发现,另一方面的原因可能是我们的特异性免疫多肽组合还不够优化。此双转基因小鼠的特性及是否适合用于治疗性乙肝疫苗的临床前研究还需要进一步的实验和证实。