结肠液囊管一期修复结直肠穿孔及吻合口漏的实验研究

摘要

研究背景与目的：
　　 结直肠穿孔发病率约为结直肠癌总数的3-8％,包括肿瘤在内的各种疾病自发性肠穿孔约为1.2-4.6％。自发性结直肠穿孔发生于乙状结肠及乙状结肠直肠交界处的系膜对侧缘>50％,因为与乙状结肠特殊生理解剖因素有关。自发性结肠穿孔多发于反应相对迟钝的60岁以上老年人,病史难于叙述清楚,加上结肠穿孔缺乏特异临床表现,早期正确诊断不足10％。由于结肠内容物含有大量细菌,穿孔确诊后已产生严重弥漫性腹膜炎,加上细菌毒素的大量吸收,形成感染抗体并导致多器官功能衰竭,故病死率可高达到35-47％。
　　 各种方式的结直肠吻合术后的吻合口漏(Anastigmatic Leakage,AL)发生率大约为3-9％,TME手术AL发生率2-19％,结肠AL病死率12.9％。
　　 也就是说我国每年需进行结直肠穿孔或AL修补的病例相当庞大。而对于上述病人的传统治疗原则上均采取肠穿孔或AL全层间断缝合浆肌层加固,同时行近段结肠腹壁造瘘,2-3个月后二期再次行造瘘肠管回纳术(肿瘤除外)。这种处理方式病程长,痛苦大,特别是腹壁造瘘留下巨大的疤疤,两次手术易导致严重肠粘连并发症以及高额费用,给患者带来极大的心理压力和躯体痛苦。如何才能安全有效地简化此类疾病的治疗流程,缩短病程,降低费用,寻求到一种微创,美观,并发症低的手术治疗方式呢?目前许多学者特别是胃肠外科医务工作者正不竭努力地进行研究。特别是近年来随着以腹腔镜为主体的微创胃肠外科的发展及各种可吸收人工生物材料的临床应用增多,使此项研究工作的进展逐渐加快。正是在这种背景下,本实验设计出结肠液囊管(colon sac duct,CSD)来有效地解决需要解决的问题。并对此项技术进行了认真科学的研究,期望这一研究能在结直肠穿孔及AL的治疗领域有所突破。
　　 研究目的:
　　 1总结既往外科临床对于结直肠穿孔及结直肠AL成功进行各种手术修复的经验,比较传统手术成功的关键因素及存在的不足,结合人体结直肠具有肛门这一个通向体外的自然通道,通过实践研究设计并制作出一种能经肛门进出,可顺利到达人体结直肠各段,并能在腹腔镜协助下对结直肠穿孔及结直肠AL进行有效一期修复的医疗器械-CSD。并对CSD各项性能进行客观检测,以求证其用于实验及临床的安全性,可靠性,有效性。
　　 2通过对实验用西藏小型猪进行动物实验研究CSD能否作为一种安全可靠的新技术对结直肠穿孔及结直肠AL进行有效的一期修复。特别是能否在结直肠穿孔或结直肠AL48～72小时以上,严重感染的腹腔环境下有效修复结直肠穿孔及结直肠AL。以传统外科手术作为对照,进一步求证CSD作为一种新技术的科学性,安全性,可靠性,有效性及微创优势。
　　 研究内容与方法：
　　 1 CSD的样品制作
　　 1.1制定预设方案:制定三种预设方案,查阅文献,预实验中对大约35kg的实验用西藏小型猪进行解剖,了解它的结直肠肠腔内径大小。作为CSD尺寸设计的依据,制定出CSD三种预设方案,并绘制出工程制作线图及立体彩图。
　　 1.2材料选择:在高分子材料工程师的帮助下,对临床上已广泛使用且被证实具有良好生物组织相容性的几种医用级高分子材料的弹性模量、断裂强度、断裂伸长率进行充分比较后选择出硅橡胶、聚氨脂用于CSD的样品制作。
　　 1.3样品制作:寻找选择样品制作单位,根据本实验提供三种设计方案的立体彩图,工程制作线图,进行模具制作,根据需要反复修改模具,制作出三种预设方案的CSD样品。
　　 1.4确定最终样品:CSD的结构如下:主要由外套囊(1)与内管(2)组成,其中外套囊两端有环形凹槽(3),用于固定及隔绝,在外套囊与内管之间形成一密闭的环形空间(4),利用热融合技术使二者粘合成一体。外套囊一端的充气管(5)与所述环形空间相通用来注射空气充盈外套囊。外套囊质地柔韧,内管质地坚硬,外套囊两端向内收缩,延伸至内层管壁。这种设计模型可用于结直肠穿孔或结直肠AL的一期修复手术。它既可阻挡肠腔内压力向穿孔或漏口处传递,又可使病变肠管与肠内容物完全隔绝。形成一个非常有效的肠腔内导流管装置,故有利于病变肠管清洁低压的环境下一期愈合,达到甚至超过传统二期手术的效果。
　　 1.52.3样品性能检测
　　 利用三通管将CSD的充气管、精密压力表进行连接,向液囊管内匀速充气,观察CSD外套囊、内管是否变形。凹槽是否外凸变浅,液囊管是否漏气或破裂,同时记录压力表所显示的压力读数。并进行统计学分析。对样品的性能作出科学客观的分析比较。
　　 2 CSD修复结直肠穿孔及结直肠AL动物实验
　　 2.1实验设计
　　 处理组采用CSD对结肠穿孔及结直肠AL进行一期修补,以传统一期穿孔或漏口缝合近段结肠造瘘,二期结肠回纳手术作为对照组,每组15例。比较两种手术方式的手术时间、术后腹腔粘连程度、安全性、可靠性、有效性。并在修补后7、14、21天检测穿孔及漏口的愈合情况:比较结直肠穿孔及漏口部位的愈合强度—爆破压,结肠愈合部位组织中微血管密度(microvesseldensity,MVD)及羟脯氨酸含量,评估CSD一期修补结直肠穿孔及结直肠AL的实用性、可靠性、安全性及微创效果。
　　 2.2动物模型制造
　　 电视腹腔镜监视下经肛门制作动物模型,采用实验用西藏小型猪,体重30-35kg。氯胺酮联合戊巴比妥麻醉。麻醉前半小时称体重,臀部肌肉内注射鲁米那钠100mg、阿托品0.5mg。麻醉诱导按氯胺酮6mg/kg耳根部注射给药进行,待实验猪安静少动时经行气管插管(7.0-7.5号)并固定,呼吸机辅助呼吸。手术过程中以氯胺酮,戊巴比妥或异丙酚静脉滴注维持。
　　 连接各线路及管道,开启调制电视腹腔镜的冷光源,CO2气腹机、高频电刀,调节腹腔镜视管的黑白及清晰度。于肚脐右上缘切约11mm皮肤皮下切口,常规建立气腹,当腹内压达到10～12mmHg状态时。以10mmTrocar穿刺成功后,置入腹腔镜视管。观察腹腔内各脏器,排除腹腔内异常情况后,从肛门置入另一视管(代替肠镜)。在腹腔镜监视下进入到距肛门约25～30cm处于肠系膜对侧缘刺破肠壁,形成大约1.0×1.2cm2穿孔,制造结肠穿孔模型。或利用举肠器有效显露距肛门约25～30cm处结肠,以电凝勾切断肠管,以丝线缝合肠管两断端,留取大约三分之一的肠系膜对侧缘肠壁不缝合,制造结肠AL模型。
　　 2.3应用CSD对结肠穿孔或AL进行一期修复
　　 第一次手术后48小时,再次手术,在腹腔镜下应用CSD对存在穿孔或漏口的结肠进行一期修复。麻醉、体位固定及消毒,铺无菌巾单同前述动物模型制造。于原脐上切口处拆除缝线,以弯钳逐步分离腹壁各层,进入腹腔,注意防止此处有肠管粘连而被破损伤,直视下,将10mmTrocar置入腹腔内,并置入10mm腹腔镜视管,仔细观察腹腔内粘连情况,避免损伤粘连肠管。在腹腔镜监视下于左右下腹合适位置,各切一长约5mm切口,并置入5mm Trocar后,置入相应的腹腔镜器械。轻柔推拉分离腹腔内粘连,清除腹腔内存留的粪便、脓苔寻找穿孔或漏口部位。如果寻找困难则以温盐水轻柔冲洗腹腔,吸净后仔细寻找。找到穿孔或漏口后,以四号丝线园针,纵行方向上缝吊,切取少许异常肠壁组织送病理。另一手术组成员以手指轻柔扩肛,逐渐扩张至2指宽后置入肛管,以大量稀释碘伏冲洗肠腔,至流出的冲洗液基本不带粪碴后使用石蜡油润滑肠腔及CSD,然后在腹腔镜监视下应用推送器将液囊管轻柔推送至肠穿孔或漏口部位,并使肠穿孔或漏口处位于液囊管的中部,缓慢均匀地对液囊管进行充气,致液囊管充分膨胀具有一定的韧性,又不致过分粗硬扩张压迫肠管,造成肠壁张力过大,影响病变部位肠管的血运。液囊管在肠腔内能具有一定的活动度为佳。在推送器内置入金属杆,使推送器灵活转变为类似于妇产科举宫器相仿的举肠器,通过举肠器的辅助使穿孔部位结肠及其系膜能上下左右摆动,并形成一定的张力,清楚地显露出结肠系膜的无血管区,利于手术者操作。手术者使用分离钳于液囊管两环形凹槽部位紧贴肠外壁穿过结肠系膜无血管区,不损伤肠壁血运情况下,用可吸收羊肠线适度捆扎肠管于液囊管上,将穿孔或漏口部位肠管与肠腔完全隔绝,大量温盐水冲洗腹腔。仔细止血,清点纱布器械,放尽腹腔积气,撤除器械,关闭各切口,固定液囊管的冲气管后结束手术。术后1小时,麻醉作用消失,给予正常饮水,术后禁食24小时,第2天开始给予无渣流质饮食。
　　 对照组的传统手术:麻醉、体位固定、消毒、铺巾、从左侧经腹直肌切口进腹、探查穿孔部位,全层缝合。手术切口前端左侧旁开大约5.0cm处,将皮肤剪一直径约3.0cm的圆形切口,电刀切开皮下组织、肌筋膜、钝性分离腹肌,切开腹膜,选择合适的结肠段,经造瘘口提出到腹外,以塑胶棒及橡胶管穿过肠系膜无血管区,将肠管固定于腹外,电刀纵行切开对系膜缘肠壁约3.0cm,将切开的肠管壁缝合固定于造瘘口上。腹腔冲洗,仔细止血,留腹腔引流管,清点纱布器械,关腹结束手术。
　　 2.4第三次手术对修复效果进行检测
　　 分别于手术后第7天、14天、21天对处理组及对照组的西藏小型猪结肠穿孔或AL修复的效果进行检测,腹腔镜下检测的项目为腹腔内粘连情况、肠AL部位有无狭窄、开腹检测肠穿孔或AL愈合部位的爆破压,并取样检测愈合肠壁组织的羟脯氨酸含量及MVD。
　　 2.4.1活体状态下结肠AL或穿孔愈合部位爆破压的测定
　　 确定CSD位置,于其近端约5.0cm处用编织带结扎结肠,放尽CSD内气体,取出CSD,将精密压力表连接管经肛门插入直肠15.0-20.0cm,用7.0号丝线荷包缝合肛门,确保不会渗气,使穿孔或AL处结肠管与精密压力表处于同一水平,缓慢匀速地向肠腔内打气,助手密切观察并记录穿孔或AL结肠修复部位漏气时压力表的读数,即为结肠穿孔或AL修补部位的爆破压。
　　 切取病变愈合部位肠壁组织,分为5份。1份浸泡在10％福尔马林中固定,进行HE染色,其余4份保存在-80℃冰箱中,分别用于检测病变愈合部位组织中羟脯氨酸含量及MVD。
　　 2.4.2 AL或穿孔愈合处组织羧脯氨酸含量测定
　　 使用碱水裂解法羟脯氨酸检测试盒:精确称取湿重组织,准确加碱水裂解液,调节PH值,在水解液中加入活性炭,取上清液,依次加入试剂,水浴,冷却,离心,取上清液,测吸光度,按公式计算样品巾羟脯氨酸含量。
　　 2.4.3 AL或穿孔愈合处组织MVD测定
　　 组织OCT包埋切片,丙酮中固定,常规水化,PBS冲洗,消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,山羊血清封闭室温孵育,倾去血清,滴加一抗工作液,PBS冲洗,滴加生物素标记山羊抗小鼠IgG,PBS冲洗,滴加辣根酶标记链霉卵白素,PBS冲洗,配置DAB工作液,滴加(DAB)显色剂显色,自来水充分轻柔冲洗,苏木素液一滴滴于组织上复染,PBS冲洗,脱水,玻片干燥后滴加中性树脂封片,微血管计数。
　　 2.5统计学分析
　　 应用SPSS13.0软件包统计分析,计量数据以均数±标准差((x)±s)表示,两组间比较采用两独立样本的t检验(双侧)分析,P<0.05为有显著性差异。
　　 结果：
　　 1样品性能检测
　　 1.1 CSD外套囊变形压力比较
　　 医用硅橡胶与医用聚氨酯制作的CSD外套囊变形压力分别为:30.42+0.46Kpa与30.73±0.29 Kpa。结果显示医用聚氨酯稍优于医用硅橡胶,但无统计学差别
　　 1.2 CSD内管变形压力比较
　　 医用硅橡胶制作的CSD内管变形压力值为5.96±0.22 Kpa,CSD的内管硬度不够,容易内突导致管腔狭窄闭合,而医用聚氨酯制作的CSD内管变形压力值大于100 Kpa时均无明显变形。故医用聚氨酯明显优于医用硅橡胶。
　　 1.3 CSD漏气压力比较
　　 用医用硅橡胶与医用聚氨酯制作的CSD漏气压力值为59.23±1.25Kpa与60.01+1.45 Kpa,结果显示医用聚氨酯稍优于医用硅橡胶,但无统计学差别。
　　 2结肠穿孔修复术后愈合部位检测
　　 2.1结肠穿孔修复术后爆破压检测
　　 术后第7、14、21天处理组与对照组爆破压分别为:26.20±2.76、36.12±1.67、38.58±1.46与21.28±0.80、27.72±1.07、35.92±2.01,处理组均优于对照组(t=3.83,P=0.005:t=9.46,P<0.001；t=2.39,.P=0.044)。
　　 2.2结肠穿孔愈合部位羟脯氨酸含量检测
　　 术后第7、14、21天处理组与对照组羟脯氨酸含量分别为:21.42±0.76、25.96±0.87、27.50±0.59与15.14±0.97、21.08±1.08、26.90±0.56,术后第7、14天处理组羟脯氨酸含量较对照组高(t=11.39；t=7.82,P<0.001),术后第21天2组无显著差别(t=1.65,P=0.139)。
　　 2.3结肠穿孔愈合部位MVD检测
　　 术后第7天处理组与对照组MVD分别为:12.40±0.89与10.40±1.14,术后第7天MVD处理组高于对照组(t=3.09,P=0.015)。
　　 3结肠AL修复术后愈合部位检测
　　 3.1结肠AL修复术后爆破压检测
　　 术后第7、14、21天处理组与对照组爆破压分别为:23.54±1.41、34.14±1.86、36.70±1.52与19.10±0.57、25.96±1.17、34.00±2.15,术后第7、14天处理组均优于对照组(t=6.54,P<0.001:t=8.31,P<0.001),术后第21天2组无显著差别(t=2.29,P=0.051)。
　　 3.2 AL愈合部位羟脯氨酸含量检测
　　 术后第7、14、21天处理组与对照组羟脯氨酸含量分别为:20.46±0.76、25.08±1.07、26.10±0.61与14.20±0.94、20.22±1.22、26.70±0.67,术后第7、14天处理组羟脯氨酸含量较对照组高(t=0.41,P<0.001；t=0.82,P<0.001),术后第21天2组无显著差别(t=0.85,P=0.179)
　　 3.3 AL愈合部位MVD检测
　　 术后第7天处理组与对照组MVD分别为:11.20±0.84与8.80+0.84,第7天MVD处理组高于对照组(f=4.54,P=0.002)。
　　 结论：
　　 1.采用聚氨酯制作的CSD结构简单、性能优良、操作方便、安全可靠,有临床应用价值。
　　 2.应用CSD技术一期修复结肠AL或穿孔是安全、可靠且有效。
　　 本研究创新之处：
　　 1自主研究设计的CSD能经肛门自由进出能到达人体结直肠各处,在腹腔镜下对结直肠穿孔及AL进行一期修补。
　　 2 CSD治疗效果安全、可靠,能有效取代传统一期修补造瘘,二期结肠回纳手术。