携带mIFN-γ基因的溶瘤病毒治疗消化系恶性肿瘤的实验研究

摘要

背景:综合治疗已经成为肿瘤治疗的一项基本原则,但是目前尚无十分令人满意的治疗方法,因此,仍在不断探索新的治疗方法。作为新的肿瘤治疗方法必须要有新的作用机制,且与目前已有的方法不存在交叉耐受。病毒治疗就是因为拥有上述特性而在近年来的肿瘤治疗中受到越来越多的关注。
　　 腺病毒具有宿主细胞范围广泛,可感染分裂和非分裂终末分化细胞,致病性低、基因组完全清楚,易于操作、不整合到染色体中,无插入致突变性、病毒滴度较高、易于纯化和制备等诸多优点而在病毒治疗中研究最多。但是由于腺病毒靶向肿瘤细胞特异性差及在某些细胞中转染效率低下等问题,仍需要进一步改造。在改造中主要是利用肿瘤生物学行为上的一些异常表现,或是对病毒的基因组进行缺失突变,或是以肿瘤/组织特异性启动子/增强子为“开关”对一些在病毒的生活周期中至关重要的基因进行调控,期望因而克服了腺病毒本身的不足,能够靶向肿瘤细胞增殖,杀死肿瘤细胞,而不损害正常细胞。目前在国际上增殖型腺病毒以ONYX-015为研究得最早也最为成功。
　　 ONYX-015是E1B-55kD缺失的腺病毒,它利用多数人类肿瘤细胞p53功能不良而正常细胞p53阳性的特点,可以特异地杀伤p53缺失或变异的肿瘤细胞。在其联合常规化疗(5-Fu、顺铂)治疗30例复发的头颈部肿瘤患者的临床实验中,临床有效率达到了63％,这是迄今最为有效的肿瘤生物治疗之一。目前已在包括头颈部肿瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等十多种肿瘤及十五个肿瘤临床中心应用。但作为单剂的治疗效果仍不佳,只有20％左右,Ⅲ期临床试验中结果也不理想。
　　 理论上,ONYX-015可以在肿瘤细胞增殖、裂解肿瘤细胞,其释放出来后又继续感染周围的肿瘤细胞,疗效可以逐步放大,直至杀灭所有肿瘤细胞。但在实际应用中由于肿瘤和病毒在生物学性状上十分复杂,其疗效影响因素众多。①在肿瘤细胞中特异性增殖仍不理想。早期的实验结果表明ONYX-015在P53突变的肿瘤细胞内特异性增殖,而在野生型P53及正常细胞不增殖；但随着实验进一步深入,ONYX-015并非在所有P53突变细胞增殖,而在野生型P53细胞不增殖,它在部分P53正常的细胞中也能增殖。②对肿瘤细胞作用广谱性不强,腺癌中p53功能异常的细胞只有34～70％。③肿瘤内部的肿瘤细胞异质性的差异、肿瘤组织内部的出血、坏死、纤维化甚至在许多情况下还有一些正常的细胞夹杂其间(有时可达50％),均不利于病毒的扩散。④在70-80％正常成人体内存在有腺病毒的中和抗体,影响病毒弥散及再感染的过程。⑤转染率不够高。
　　 因此,我们从两方面对腺病毒进一步改造。(1)提高病毒对肿瘤细胞的特异性和广谱性。我们选择了目前被认为是最广谱、最特异的肿瘤分子标记——端粒酶。端粒酶与肿瘤无限增殖的特性有关,在85％以上的肿瘤中为阳性(消化系恶性肿瘤细胞中80％～100％阳性),而在绝大多数的正常细胞中为阴性。人端粒酶逆转录酶(hTERT)对端粒酶的活性起着关键的调控作用。hTERT启动子只有在端粒酶阳性的细胞中有转录活性。因此,腺病毒在hTERT启动子的调控下具有在肿瘤细胞特异性增殖,而正常细胞不能增殖的能力。(2)以增殖腺病毒为载体携带的抗癌基因,利用基因治疗杀灭部分对病毒不敏感的肿瘤细胞,增强病毒对肿瘤的杀伤作用。在抗癌基因筛选中,我们选择了γ-干扰素(IFN-γ)。这是由于IFN-γ具有以下优点:①促进机体肿瘤监督的免疫活性,抑制癌前基因、癌基因的表达,②IFN-γ自身及其诱导的巨噬细胞产生的IL-2,可诱导Th1细胞功能,增强细胞毒性T细胞的产生,从而发挥抗肿瘤效应；③上调肿瘤相关抗原的表达,增加肿瘤细胞对MHC限制的CD8+细胞毒T细胞溶瘤的敏感性；④可以抑制新生血管的产生,起到抑制肿瘤生长的作用；⑤通过诱导Th2向Th1分化,从而减少病毒抗体产生,使病毒不仅可以通过血流弥散全身各部位肿瘤,而且使病毒可以反复使用。但在既往IFN-γ肿瘤治疗的临床试验中,其疗效并不理想。这是由于IFN—γ采用原核表达,体内半衰期短,仅为15分钟,需要给患者高半剂量反复注射方能取得一定的疗效,往往副作用严重。而我们应用增殖病毒携带γ-干扰素作为治疗基因。理论上腺病毒在hTERT启动子调控下只在端粒酶阳性的肿瘤细胞细胞中增殖,而目的基因的拷贝随着病毒的增殖得以扩增,大量表达有抗癌活性的剂量依赖型的细胞因子IFN-γ,在肿瘤局部形成高浓度,从而在不增加毒性的情况下协同腺病毒充分发挥抗肿瘤活性。
　　 目的:在前期研究中我们将小鼠的IFN-γ基因成功能克隆入hTERT启动子调控的增殖型腺病毒载体中,建成了CNHK300-Mγ。本实验以ONXY-015、CNHK300和AdEasy-Mγ(携带mIFN-γ的非增殖病毒)作为对比,系统地研究了CNHK300-Mγ体外和荷瘤动物模型中对消化系肿瘤的抑瘤效应和治疗基因mIFN-γ的表达情况,为消化系恶性肿瘤的病毒-基因治疗和针对端粒酶为靶点的治疗策略提供新的思路。
　　 方法:
　　 1.溶瘤病毒CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞的体外实验研究:以ONXY-015、CNHK300和AdEasy-Mγ为参照对象,采用病毒增殖实验评估CNHK300-Mγ在常见消化系恶性肿瘤细胞株和正常成纤维细胞株中的增殖能力；采用的细胞病理效应(CPE)和细胞活力检测(MTT)评估CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞株和正常成纤维细胞株的杀伤能力；采用Western Blot试验和ELSA试验来检测CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ感染消化系恶性肿瘤细胞株和正常成纤维细胞株后mIFN—γ表达的差异。
　　 2.溶瘤病毒CNHK300-Mγ治疗肝癌动物模型的研究:采用SMMC-7721裸鼠肝癌动物模型和Hepal-6小鼠肝癌动物模型进行瘤内注射病毒治疗,测量肿瘤大小,观察与ONXY-015、CNHK300、AdEasy-Mγ和对照组的抑瘤差异:进行动物血清mIFN-γ的检测,评估CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ表达治疗基因的差异；进行肿瘤常规HE染色检查和免疫组化检查肿瘤组织中腺病毒外壳蛋白Hexon表达情况、代表微血管密度的阳性细胞和代表免疫状态的LCA+、CD4、CD8的表达情况。
　　 结果:
　　 1.溶瘤病毒CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞的体外实验研究
　　 1)病毒增殖实验发现:CNHK300-Mγ在正常成纤维细胞株BJ和MRC-5中增殖能力很低,最高只有100左右；而在消化系恶性肿瘤细胞株HepG2、SMMC-7721、PANC-1、HT29、SGC-7901中增殖能力明显增强,均超过25000倍；后者是前者的248-1259倍之间。CNHK300-Mγ和ONYX-015在正常细胞株中增殖能力相似,但在消化系恶性肿瘤细胞株中增殖能力明显增强,在HepG2细胞株中是后者的5倍,在其余肿瘤细胞株中是后者的2/～313倍。
　　 2)细胞病理效应(CPE)发现:CNHK300-Mγ对肿瘤细胞株有强大的杀伤能力,在MOI值为1时均基本杀灭；而正常细胞株至MOI值为100时才有部份杀伤力,明显低于肿瘤细胞株中。
　　 3)MTT试验也有类似CPE的结果:CNHK300-Mγ对消化系恶性肿瘤细胞株有明显的杀伤作用,当MOI在1以下时可以杀伤半数的各种肿瘤细胞,而对正常细胞均在200以上。与ONYX-015相比,在肿瘤细胞中有更强的杀伤力,ONYX-015的IC50所需的的MOI值分别是CNHK300-Mγ数倍至近百倍,在HepGII、SMMC-7721、PANC-1、HT29、SGC-7901中分别为4.16、93.7、23.91、72.95和8.63倍,但在正常细胞中两者IC50值相近。
　　 4)Western Blot和mIFN-γ的表达量的测定:肿瘤细胞受CNHK300-Mγ感染后均有大量mIFN-γ的表达,随着感染的时间延长,mIFN-γ的表达量均有较明显上升。同一种肿瘤细胞受CNHK300-M Y感染后mIFN—γ的表达量明显高于受AdEasy—Mγ感染的,差值在141—1245倍之间(3天时)和614-5150倍之间(7天时)。
　　 2.溶瘤病毒CNHK300-Mγ治疗肝癌动物模型的研究
　　 1)应用CNHK300-Mγ治疗后,可使肿瘤增长明显缓慢,肿瘤体积的大小与ONXY-015、CNHK300、AdEasy-Mγ和PBS对照组均差异显著。裸鼠肝癌SMMC-7721动物模型抑瘤率在CNHK300-Mγ、CNHK300、ONXY-015、AdEasy-Mγ分别为73.32％、42.88％、19.86％和6.76％。(CNHK300-Mγ与ONYX-015、AdEasy-Mγ和PBS对照组的P值均小于0.001,CNHK300和CNHK300-Mγ之间为0.029)；Hepal-6小鼠肝癌动物模型中抑瘤率在CNHK300-Mγ、CNHK300、AdEasy-Mγ分别为90.32％、61.94％和57.66％。(CNHK300-Mγ与CNHK300、AdEasy-Mγ和PBS对照组的P值均小于0.001)。
　　 2)血清中mIFN-γ表达量检测,证实CNHK300-Mγ治疗后1周内,mIFN-γ表达量呈成倍升高的趋势。CNHK300-Mγ组在治疗结束后3天,7天分别为231±101pg/ml和1733±191pg/ml；AdEasy-Mγ组在治疗结束后3天为20±10pg/ml,第7天未检测到。
　　 3)在SMMC-7721肝癌动物模型中,免疫组化检测肿瘤组织Hexon的表达情况,发现CNHK300-Mγ治疗组和CNHK300治疗组的肿瘤细胞内有阳性表达,对照PBS组无阳性表达。HE染色发现CNHK300-Mγ组与对照组相比肿瘤中央有较多坏死。vWF免疫组化染色,显示代表微血管密度的阳性细胞数目CNHK300-Mγ组、CNHK300组、AdEasy-Mγ组和PBS处理组分别为81.0±6.2、、129.4±9.93、152.8±9.8和183.3±15.3,四组间P小于0.001。
　　 4)在Hepal-6动物模型中,肿瘤组织的LCA+、CD4和CD8的表达在不同组间结果如下:CNHK300-Mγ组分别为577.800±76.741,343.250±51.331和207.750±19.172,AdEasy-Mγ分别组为241.800±44.779,124.750±40.277和100.750±12.420,PBS照组分别为122.4±26.121,74.250±17.308,74.000±9.661。CNHK300-Mγ治疗组与AdEasy-Mγ组和PBS对照组的差异明显,具有统计学意义,P值均小于0.001。
　　 结论:
　　 1.hTERT启动子调控的溶瘤病毒CNHK300-Mγ在端粒酶阳性的消化系恶性肿瘤细胞株HepG2、SMMC-7721、PANC-1、HT29、SGC-7901中均能够大量增殖制并杀灭肿瘤细胞,均强于ONXY-015,而在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株BJ、MRC-5中增殖很弱,杀伤力也AdEasy—Mγ近似,显示CNHK300-Mγ比ONYX-015在正常细胞中进一步减毒。
　　 2.CNHK300-Mγ感染消化系恶性肿瘤细胞后均有大量mIFN-γ的表达,荷瘤鼠瘤内注向后能在血清中检测到,均与AdEasy-Mγ差异显著,这提示与非增殖型腺病毒相比,利用增殖型腺病毒携带治疗基因,能使治疗基因有更好的表达。
　　 3.SMMC-7721裸鼠肝癌动物模型和Hepal-6小鼠肝癌动物模型应用CNHK300-Mγ治疗后,肿瘤增长明显缓慢,与ONXY-015、CNHK300、AdEasy-Mγ相比,CNHK300-Mγ是有更强抑瘤作用的新型溶瘤病毒。
　　 4.肿瘤组织Hexon染色提示CNHK300-Mγ瘤内注射后能在病毒能局部增殖、复制。肿瘤组织中微血管密度明显下降,LCA+、CD4和CD8的表达明显增加,提示CNHK300-Mγ治疗肿瘤不仅有病毒增殖杀灭肿瘤而且通过大量表达有抗瘤作用的mIFN—γ,发挥基因抗瘤作用,CNHK300-Mγ能发挥病毒治疗和基因治疗的双重作用。