EpCAM及HNF4alpha蛋白在肝细胞癌中的表达及其与预后的相关性研究

摘要

研究背景和目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcmoma,HCC)简称肝癌,是全球最常见的恶性肿瘤之一。我国是世界上肝癌高发区之一,发病率为20.37/10万,位于常见肿瘤的第3位。2002年全球最新统计,肝癌发病率在常见恶性肿瘤中排行第6位,而病死率则排第3位,每年发病人数为62.6万例,新增5.7％,共有59.8万例死亡,其中82％在发展中国家,中国占55％。虽然目前临床上治疗肝癌的手段比较多,包括手术切除、肝移植、血管介入、消融技术、放化疗等,且在肝癌的药物治疗上取得了重大突破,但手术切除仍被公认为肝癌获得根治的最好手段。但即使是根治性切除,5年内仍有60～70％的病人出现转移复发,而局部治疗的转移复发率更高。抗肿瘤转移复发的治疗已成为提高肝癌生存率的关键。因此,寻找预测肝癌转移复发倾向、判断肝癌患者预后的肿瘤标志物是目前肝癌研究的重点及热点,也是肝癌防治研究中的一个重点和难点。
　　 上皮细胞黏附分子(EpCAM；又被称为CD326,CO17-1A,EGP,EGP40,GA733-2,KSA,Ly74,M1S2,M4S1,MIC18,MK-1,TROP1,hEGP-2),是第一个被识别的肿瘤相关抗原之一,它的编码基因是TACSTD1。EpCAM在人类多种腺癌和鳞状细胞癌中高表达,尽管目前对EpCAM的功能及其调控机制不甚明白,但它仍然被认为可以作为肿瘤信号蛋白及在细胞-细胞的黏附之间起作用。基因表达测序研究推测EpCAM可能是肝细胞癌的早期生物标志物,因为它在肝组织的癌前病变及部分肝细胞组织中高表达,另外一些研究也证实了EpCAM在肝细胞癌形成和发展中的重要作用。在EpCAM阳性的肝癌细胞表面检测到干/祖细胞的分子标志物,如c-Kjt,CK19,vimentin,CD133,and AFP,以及可以活化的Wnt信号通路,表明EpCAM阳性细胞具有肝祖细胞(HPCs)明显的分子特征,并且EpCAM的表达与Wnt信号通路活化之间有明显的相关关系。正常肝细胞EpCAM呈阴性表达而胚胎肝细胞则呈阳性表达,很多研究已经证实EpCAM可以作为肝干细胞的标志。
　　 肝细胞核因子4 alpha(HNF4alpha,NR2A1,基因符号HNF4A)是配体依赖性转录因子核受体(nuclear receptor,HR)超家族的一员,是一种高度保守的基因,在成年和胚胎时期发展上均可起重要作用。HNF4alpha在成年肝脏、肾脏、胰腺、小肠、结肠中均有表达,而在胃及内脏内胚层表达较少。HNF4alpha作为一个核蛋白与DNA特异结合为同型二聚体,这一点与其他核受体不同,并可使上百个基因的表达活化,特别是参与代谢的基因,如糖、脂肪酸、胆固醇、无机物和药物代谢。最近有报道称在生理条件下,HNF4alpha可与一个单一脂肪酸(亚麻酸)可逆性结合,这一发现可能使HNF4alpha作为一个潜在的药物治疗靶点。HNF4alpha是HNFs和NRs复杂网络系统中的中心环节,并且与人类多种疾病有关,包括糖尿病、血友病和HBV感染。
　　 本研究拟应用组织芯片技术及免疫组化方法检测EpCAM蛋白在人体常见肿瘤组织及癌旁组织中的分布及表达,并分析EpCAM蛋白在肝细胞癌及其癌旁组织中表达的差异；应用免疫组化方法检测肝细胞癌组织中EpCAM蛋白和HNF4alpha蛋白表达,与各临床病理参数之间的关系进行统计分析,结合临床随访资料回顾性分析EpCAM蛋白和HNF4alpha蛋白表达与肝细胞癌患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)的关系,寻找监测肝细胞癌转移复发及评价预后的方法；分析EpCAM蛋白与HNF4alpha蛋白表达水平之间的相关关系,并将两个蛋白高、低不同表达水平分为四个小组后,再对肝细胞癌患者的无病生存期和总生存期分别进行统计学分析；为肝细胞癌的诊断、疗效评价、术后监测、预后判断及治疗靶点的选择提供初步的理论依据。
　　 方法
　　 1.EpCAM蛋白在人体常见恶性肿瘤组织及癌旁组织中的分布及表达应用组织芯片技术及免疫组织化学方法检测EpCAM蛋白在人体常见肿瘤组织及癌旁组织中的分布及表达；检测EpCAM蛋白在肝细胞癌组织及其癌旁组织中的表达；分析肝细胞癌组织及其癌旁组织中EpCAM蛋白表达水平有无差异。
　　 2.EpCAM蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义应用免疫组织化学方法检测EpCAM蛋白在86例肝细胞癌组织中的表达情况；分析EpCAM蛋白表达水平与各临床病理参数之间的关系；分析EpCAM蛋白表达与肝细胞癌患者无病生存期、总生存期的关系；建立COX回归模型,对各项指标与生存期的关系进行统计分析。
　　 3.HNF4alpha蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义应用免疫组织化学方法检测HNF4alpha蛋白在86例肝细胞癌组织中的表达情况；分析HNF4alpha蛋白表达水平与各临床病理参数之间的关系；分析HNF4alpha蛋白表达与肝细胞癌患者无病生存期、总生存期的关系；建立COX回归模型,对各项指标与生存期的关系进行统计分析。
　　 4.EpCAM蛋白与HNF4alpha蛋白表达水平之间的相关性分析,及四个不同组合肝细胞癌患者无病生存期、总生存期之间的关系分析随访获得的86例肝细胞癌组织中,EpCAM蛋白与HNF4alpha蛋白表达水平之间的相关关系；同时分析两蛋白高低不同表达组合为四个小组后与肝细胞癌患者无病生存期和总生存期之间关系进行统计学分析。
　　 5.统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计学处理,肝细胞癌组织及其癌旁组织EpCAM蛋白的表达率及表达强度的比较分别应用x2检验及Wilcoxon秩和检验:以x2检验和Fisher's精确概率法对EpCAM及HNF4alpha蛋白表达率与肝细胞癌患者各临床病理参数之间的关系进行统计学分析；对EpCAM及HNF4alpha蛋白表达与肝细胞癌患者无病生存期、总生存期的关系应用Kaplan-Meier法进行生存分析；各临床病理参数与无病生存期、总生存期的关系进行COX回归分析；HNF4alpha蛋白表达水平与EpCAM蛋白表达水平的相关性分析采用spearman相关性分析；采用以P≤0.05为具有显著性差异。
　　 结果
　　 1.EpCAM蛋白在人体常见肿瘤组织及其癌旁组织中分布和表达情况EpCAM蛋白在人类常见的上皮性肿瘤组织中可见较强表达,如结肠腺癌、食管鳞癌、肺鳞癌、胃腺癌、胰腺癌、直肠腺癌等,在相应的癌旁组织中也可见表达,但表达的强度及范围明显低于肿瘤组织。肝细胞癌组织EpCAM蛋白表达率及表达强度显著高于癌旁组织(P<0.05)。
　　 2.EpCAM蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义EpCAM蛋白在肝细胞癌细胞胞膜及胞浆中表达,表达率为89.4％,高表达率为55.9％,各级表达所占比例分别为:“-”占10.6％(9/86),“+”占32.5％(25/86),“+”占23.4％(21/86),“+++”占32.5％(28/86)。EpCAM蛋白表达与肝细胞癌患者的性别、年龄、血清HBsAg、血清AFP、肿瘤大小、肝硬化、病理分级、TNM分期无相关性(P>0.05),而与转移复发存在相关性(P<0.05)。EpCAM蛋白高表达肝细胞癌患者较低表达患者术后发生转移复发早。随访发现EpCAM蛋白高表达肝细胞患者的中位无病生存时间为4.0个月,EpCAM蛋白低表达肝细胞癌中位无病生存时间为29.0个月。EpCAM蛋白高表达肝细胞癌患者中位无病生存时间显著低于EpCAM低表达患者(P=0.002<0.05)。将EpCAM蛋白表达水平及各临床病理参数与肝细胞癌患者的无病生存时间分别进行统计学分析,结果显示EpCAM蛋白表达、血清AFP和TNM分期是影响肝细胞癌患者无病生存时间的因素(P值分别为:0.013、0.012、0.008),COX回归分析结论相同。
　　 将EpCAM蛋白表达水平及各临床病理参数与肝细胞癌患者的总生存时间分别进行统计学分析,结果显示EpCAM蛋白表达、血清AFP、肝硬化、肿块大小、转移复发是影响肝细胞癌患者总生存时间的因素(P值分别为:0.008、0.003、0.048、0.039、0.000),COX回归分析发现术后转移复发、血清AFP是影响肝细胞癌患者总生存时间的独立因素(P值分别为:0.003、0.044)。
　　 3.HNF4alpha蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义HNF4alpha蛋白表达于肝细胞癌细胞的胞核及胞浆,表达率为81.4％,高表达率为46.5％,各级表达所占比例分别为:“-”占18.6％(16/86),“+”占34.9％(30/86),“++”,占31.3％(27/86),“+++”占15.2％(13/86)。HNF4alpha蛋白表达与肝细胞癌患者的性别、年龄、血清HBsAg、肝硬化、肿瘤大小、TNM分期及转移复发无相关性(P>0.05),而与血清AFP、病理分级存在相关性(P<0.05)。HNF4alpha,蛋白高表达肝细胞癌患者的中位无病生存时间为22.0个月,HNF4alpha蛋白低表达肝细胞癌中位无病生存时间为4.0个月。HNF4alpha高表达肝细胞癌患者中位无病生存时间显著长于HNF4alpha低表达患者(P=0.007<0.05)。将HNF4alpha蛋白表达水平及各临床病理参数与肝细胞癌患者的无病生存时间分别进行统计学分析,结果显示HNF4alpha蛋白表达、血清AFP、TNM分期是影响肝细胞癌患者无病生存时间的因素(P值分别为:0.007、0.000、0.004)。COX回归分析发现血清AFP、TNM分期是影响肝细胞癌患者无病生存时间的独立因素(P值分别为:0.002、0.017)。
　　 将HNF4alpha蛋白表达水平及各临床病理参数与肝细胞癌患者的总生存时间分别进行统计学分析,结果显示HNF4alpha蛋白表达、转移复发、肝硬化、血清AFP、肿瘤大小是影响肝细胞癌患者总生存时间的因素(P值分别为:0.021、0.000、0.048、0.003、0.039)。COX回归分析发现HNF4alpha蛋白表达、转移复发是影响肝细胞癌患者总生存时间的独立因素(P值分别为:0.038、0.001)。
　　 4.EpCAM蛋白与HNF4alpha蛋白表达的相关性分析,及其四个不同组合肝细胞癌患者无病生存期、总生存期之间的关系的临床意义将EpCAM蛋白与HNF4alpha蛋白表达情况应用spearman相关性分析进行统计学分析,发现两个蛋白之间存在显著负相关关系(r=-0.226,P=0.038)。两个蛋白高、低不同表达水平组合后的四个小组的无病生存期、总生存期进行统计学分析发现,EpCAM蛋白高表达+HNF4alpha蛋白低表达患者中位无病生存时间为3.5月,EpCAM蛋白高表达+HNF4alpha蛋白高表达患者中位无病生存时间为12.0月,EpCAM蛋白低表达+HNF4alpha蛋白低表达患者中位无病生存时间为8.0月,EpCAM蛋白低表达+HNF4alpha蛋白高表达患者中位无病生存时间为36.0月。EpCAM蛋白高表达+HNF4alpha蛋白低表达患者的无病生存期明显短于其他三个小组(P值均<0.05),其余小组间的无病生存期无显著性差异(P值均>0.05)。
　　 EpCAM蛋白高表达+HNF4alpha蛋白低表达患者与EpCAM蛋白低表达+HNF4alpha蛋白高表达患者总生存之间存在显著性差异(P=0.001):EpCAM蛋白低表达+HNF4alpha蛋白高表达患者与EpCAM蛋白高表达+HNF4alpha蛋白高表达患者之间总生存有统计学意义(P=0.048)。
　　 结论
　　 1.EpCAM蛋白在肝细胞癌中高表达,在多种肿瘤组织中同样高表达,提示EpCAM在肝细胞癌及上皮性肿瘤发生发展中的特殊意义,值得进一步探讨:
　　 2.EpCAM蛋白在肝细胞癌患者组织中高表达,而在肝炎、肝硬化、脂肪肝等患者组织中低表达,提示EpCAM有可能作为对肝细胞癌诊断及鉴别诊断有参考价值的生物标志；
　　 3.EpCAM蛋白表达与转移复发相关,且EpCAM蛋白与肝细胞癌患者预后密切相关,但不是影响肝细胞癌患者生存的独立危险因素,EpCAM蛋白高表达肝细胞癌患者发生转移复发的风险显著升高,提示EpCAM与肝细胞癌发生发展关系密切,EpCAM有可能作为肝细胞癌转移复发监测及预后判断的重要参考指标；
　　 4.HNF4alpha蛋白表达与血清AFP、病理分级相关,HNF4alpha蛋白、血清AFP和TNM分期是影响患者无病生存时间的重要因素,但HNF4alpha蛋白不是预测无病生存时间的独立危险因素；HNF4alpha蛋白与肝细胞癌患者预后密切相关,HNF4alpha蛋白低表达肝细胞癌患者发生转移复发的风险显著升高,提示HNF4alpha与肝细胞癌发生发展关系密切,HNF4alpha有可能作为肝细胞癌转移复发监测、预后判断的重要参考指标。
　　 5.EpCAM蛋白表达与HNF4alpha蛋白表达之间存在显著负相关关系,提示两者在肝细胞癌发生发展中可能存在相互竞争、相互抑制的作用,而两者联合检测可大大提高术后无病生存时间和总生存时间的预测效果。