湘琼两地蝙蝠携带星状病毒与诺如病毒的调查研究

摘要

研究背景和目的:研究表明,蝙蝠是多种人兽共患疾病病毒的自然宿主,并可以跨越物种间屏障,将病毒传播给人类和其他动物。目前研究人员已经从蝙蝠身上发现或分离很多种病毒,约有18个病毒科包含70多种病毒。已知能从蝙蝠传播给人类的病毒主要有狂犬病毒、尼巴病毒、亨德拉病毒,还有类SARS冠状病毒,这些病毒都可以引起人类致命性的疾病。其他病毒,如甲病毒属、黄病毒属和布尼亚病毒属病毒可通过节肢动物传播给蝙蝠,但还不确定蝙蝠是不是这类病毒所致疾病的播散宿主。可见,还需要大量研究,以明确蝙蝠在病毒性自然疫源性疾病中所扮演的角色。
　　 我国约有120种蝙蝠,但国内对蝙蝠的研究工作起步较晚,对其生态学、行为学研究尚不够深入,尤其是对我国蝙蝠携带哪些种类病毒,以及病毒与蝙蝠生态学的关系,对人类健康的影啊的研究还较少。迄今为止,我国科研工作者对蝙蝠所携带病毒的研究有以下发现:从蝙蝠体内分离到罗斯河病毒、乙型脑炎病毒、基孔肯雅病毒、森林脑炎病毒、SARS类冠状病毒、狂犬病病毒、星状病毒、尼巴病毒等。这些发现表明我国蝙蝠可携带某些我国常见传染病的病毒。
　　 病毒性胃肠炎(viral gastroenteritis)又称病毒性腹泻,是一组由多种病毒引起的急性肠道传染病。临床特点为起病急、恶心、呕吐、腹痛、腹泻,排水样便或稀便,也可有发热及全身不适等症状,病程短,病死率低。病毒性腹泻在儿童中更是一种常见病和多发病,是导致儿童死亡的重要原因。引起儿童腹泻的病毒主要有轮状病毒(rotavirus)、肠道腺病毒(adenovirus)、星状病毒(astrovirus,Astv)、诺如病毒(norovirus,NoV)等。
　　 患者与无症状带毒者是病毒性胃肠炎的主要传染源。粪-口途径传播是病毒性胃肠炎最重要的传播途径,少部分可以通过空气传播,其可通过被污染的食物或水引起人群胃肠炎暴发或散发。回顾上世纪90年代的亨德拉病毒和尼帕病毒的暴发事件,也是源于食源性感染,是由于蝙蝠病毒污染了水域、水果,再依次传播给马、猪、人,最后导致疾病暴发。
　　 星状病毒(Astrovirus,Astv)于1975年在胃肠炎患儿粪便标本中首次发现,由于电镜下病毒颗粒呈星形,因此被命名为星状病毒。此后世界各地均已有星状病毒感染的报道,它既可散发也可以引起暴发流行,亦可引起医源性感染。住院腹泻患儿中星状病毒检出率为2.5％～9.0％,目前认为星状病毒是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因,仅次于轮状病毒。
　　 星状病毒既可感染人,也可感染牛、羊、猪、狗、鹿、火鸡、鸭、鼠等多种动物,导致不同程度的胃肠炎。人群感染的星状病毒,传统上可分为8个血清型。最近,研究者又在腹泻病人中发现两种的新星状病毒,astrovirus MLB和astrovirus VA。研究还发现,Astv MLB1与新近发现的鼠星状病毒很相近；Astv VA1在进化树上与感染羊和貂的星状病毒最为接近。这提示新发现的人星状病毒可能和动物的星状病毒存在一定的关系。
　　 近年来,香港大学研究小组分别从香港和中国大陆的蝙蝠体内检出星状病毒,检出率高达46％和44.8％；基因分析显示蝙蝠星状病毒具有高度基因多态性,部分病毒可能与感染人的星状病毒有系统进化的关系。然而关于蝙蝠星状病毒的生态学资料还很稀少,有必要进一步扩充不同地区和不同种类的蝙蝠样本进行研究。
　　 诺如病毒(Norovirus,NoV)是一组杯状病毒属病毒,其原型株诺瓦克病毒于1972年在美国诺瓦克市被分离发现。由于该组病毒极易变异,此后在其他地区又相继发现并命名了多种类似病毒,统称为诺如病毒。NoV是一种高致病的、传染性极强的肠胃病毒,能导致急性胃肠炎,一旦有人感染,通常会发展为群体性的大规模传染。遗憾的是,由于病毒的高度变异性及其缺少合适的动物研究模型,现今还未研发出理想的NoV疫苗,患者容易发生反复感染。
　　 自然界中携带NoV的物种很多,包括有人、猪、牛、鼠、海狮等,可导致它们发生不同程度的症状。根据基因特征,NoV被分为五个遗传群(Gene Group,GG):GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GGⅤ。五个遗传群中,GGⅠ、GGⅡ和GGⅣ主要感染人类,GGⅢ感染牛,GGⅤ则在鼠类动物内检出。
　　 虽然研究已表明NoV在多种动物体内广泛存在,但是关于动物NoV感染的流行病学还不太清楚。动物NoV在动物体内感染率差别较大,研究发现北美的实验鼠鼠类NoV的感染率高达22.1％,英国检测发现牛的腹泻病例中有11％比例为NoV感染所致,而猪NoV检出率比较低,在日本猪GGⅡ NoV的检测率仅为0.35％,在荷兰检测率为2.0％。
　　 尽管现今没有证据表明动物NoV可以感染人类,但是分子生物学分析表明动物NoV和人类NoV的毒株相互之间有密切的关系,尤其是猪NoV的毒株可被归入到与人类NoV毒株相同的基因群(GGⅡ)。新近研究发现猪体内普遍存在人NoV的抗体,这进一步加强了动物可能充当着人类NoV储存库的假设。此外,研究还发现贝壳类动物可同时携带人类NoV和动物NoV,这提示一种新的基因重组株可能出现。最近,在加拿大人们检测到猪NoV和牛NoV的序列与入NoVGGⅡ.4毒株的序列非常接近。因此,将来或许要重新评估NoV种间传播的可能性及其人畜共患的风险。
　　 2009年,武汉病毒研究所在蝙蝠体内检测到另一种导致人腹泻的病毒-肠道腺病毒,检出率为8％(28/350),基因分析显示蝙蝠腺病毒亦具有高度基因多样性,这提示蝙蝠可能有携带一系列高变异病毒的能力。研究已经在蝙蝠体内发现了星状病毒和腺病毒两种腹泻相关病毒,关于蝙蝠是否携带有NoV,暂未见有文献报道,因而我们不禁疑问蝙蝠是否携带有可导致爆发流行的NoV。鉴于NoV的高度基因变异性和多宿主性,作为种类第二多的哺乳动物(1000多种)—蝙蝠也很有可能携带此类病毒,甚至可能是它们的宿主。
　　 因此,为进一步了解不同地区不同种类蝙蝠携带星状病毒的本底情况,探讨其与感染人星状病毒的关系,同时了解这些地区的蝙蝠是否携带诺如病毒,本研究拟在先前未见报道的湖南、海南部分地区为现场,对当地蝙蝠携带星状病毒和诺如病毒情况进行流行病学调查。
　　 研究方法
　　 1.样本的采集和处理2007年7月至2008年7月,于岳阳、邵阳、海口三地区蝙蝠长期监测点中选取4个蝙蝠自然栖息地,现场捕捉蝙蝠,进行编号后,请蝙蝠研究专家进行鉴定。标本采集方式分两种,分别为采集肛拭子和剪取直肠组织。采集的样本存放于含200μl RNAlater储存液的冻存管中,置放于密封的冰袋泡沫盒中当天运回实验室,放于-80℃冰箱贮存,待检。
　　 2.蝙蝠病毒的检测与鉴定
　　 2.1.星状病毒
　　 ①半巢式PCR筛检样本参照文献,针对星状病毒高度保守的RdRp基因,设计合成5条用于巢式PCR的引物,包括4条前引物和1条共同的后引物,应用巢式PCR方法检测标本。
　　 ②序列鉴定与分析对阳性PCR产物进行切胶、纯化和回收,然后送样至公司测序。如遇阳性PCR产物条带很弱者,则先做克隆,再取接种培养后菌液送样至公司测序鉴定。
　　 ③将测序结果导入GenBank的BLAST软件进行在线同源性分析,然后在GenBank下载相关核酸序列,利用Clastal X软件对所要分析的序列进行多序列比对分析,并用DNAstar软件对核酸序列相似性进行计算。使用MEGA4.1软件,用Neighbor-Joining法构建进化树进行分析。
　　 2.2.诺如病毒
　　 ①TaqMan real-time PCR检测基因组Ⅱ型诺如病毒(GGⅡ NoV)参照文献并合成用于检测GGⅡ NoV公认的特异引物和探针,利用TaqManreal-time PCR方法对本进行检测。
　　 ②SYBR Green real-time PCR检测诺如病毒参照文献合成可检测NoV的两对通用引物P289/P290和12Y/13I,应用SYBR Green real-time PCR方法分别检测标本。
　　 ③GGV型NoV特异引物检测标本参照文献合成公认的可检测GGV型NoV引物,应用普通RT-PCR方法检测标本。
　　 ④对普通RT-PCR扩增获得的可疑阳性PCR产物进行切胶、纯化和回收,然后送样至公司测序。对TaqMan real-time PCR检测的可疑阳性PCR产物,送样至公司克隆鉴定。
　　 3.质量控制
　　 ①移液枪头、冻存管、EP管等实验耗材均为一次性用品。
　　 ②RNA提取和逆转录实验所采用的所有容器和配制试剂用DEPC水处理,高温高压处理,烘干待用,以去除RNA酶污染。
　　 ③全程戴口罩、手套、帽子,在无菌室生物安全柜进行操作,防止试剂和实验过程受到污染。
　　 ④实验过程严格设立阳性对照、阴性对照和空白对照。
　　 结果
　　 1.蝙蝠基本情况本次研究在湖南、海南两省四个监测点共采集蝙蝠321只,涉及2个蝙蝠亚目4个蝙蝠科9个种类的蝙蝠。共制备蝙蝠粪便标本321份,包括肛拭子59份和直肠样本262份。
　　 2.星状病毒的检测
　　 ①巢式RT-PCR检测到阳性标本29例,总阳性率为9.03％(29/321),在9种表面健康的蝙蝠中发现有3种蝙蝠携带有星状病毒,阳性蝙蝠种类包括长翼蝠(22/187)、小黄蝠(6/38)和棕果蝠(1/59),以小黄蝠的检出率最高。
　　 ②以星状病毒RdRp基因部分氨基酸序列构建的进化树分析显示,本研究检测的蝙蝠星状病毒不仅与来源于其他种类的星状病毒差异较大,而且本身也有很大的差异。然而,有5个蝙蝠星状病毒却与羊星状病毒(ovine Astv)、貂星状病毒(mink Astv)和人新型星状病毒Astv VA在进化树上最为相近,序列相似性为51.6％-63.1％。另外,有8株从邵阳地区同一个洞穴长翼蝠检测到的星状病毒相聚在一小分支,它们的氨基酸序列相似性为97％-99％。
　　 3.诺如病毒的检测本研究采用TaqMan real-time PCR、SYBR Green real-time PCR和普通RT-PCR三种实验方法,应用多对引物分别筛查上述蝙蝠粪便样本GGⅠ～Ⅳ型NoV携带情况,检测结果均为阴性。
　　 结论
　　 ①巢式PCR检测到星状病毒阳性率为9.03％(29/321),并首次在果蝠身上检出星状病毒(1/59),提示此类星状病毒可能适应于翼手目动物,尽管不同种类的蝙蝠对它的易感程度不一。
　　 ②本研究检出的蝙蝠星状病毒基因多态性丰富,这结果与先前研究一致。5株蝙蝠星状病毒却与羊星状病毒、貂星状病毒、人星状病毒AStv VA在进化树上最为相近,并具有较高的氨基酸序列相似性。这提示蝙蝠星状病毒可能跨种族传播给人类或其他动物,亦或是在它们之间相互传播。
　　 ③来自邵阳同一个洞穴检测得到的8株星状病毒具有高度的基因相似性,进一步提示蝙蝠星状病毒在同一个洞穴内传播的可能。
　　 ④本研究从所收集的321份蝙蝠粪便样本中未检测到诺如病毒,提示蝙蝠携带诺如病毒的可能性不大。由于诺如病毒高度遗传变异,而且现今没有一对单独引物可同时检测出全部五个基因组的诺如病毒。蝙蝠是否携带诺如病毒还不清楚,有待进一步研究。