广东和广西部分地区蝙蝠携带登革病毒及流行性乙型脑炎病毒的调查研究

摘要

研究背景和目的 登革热(Denguefever,DF)和流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，JE，也称为日本脑炎，简称乙脑)是重要的虫媒病毒传染病，其病原体分别为登革病毒(Denguevirus，DV)和乙脑病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)。近年来在东南亚、印度、西太平洋和南美洲大部分地区经常爆发登革热。爆发规模越来越大，情况越来越严重，其中登革出血热(Denguehemorrhagicfever，DHF)的比例也越来越大。乙脑在亚洲每年有3,000～5,000份临床病例报道，其流行范围也有不断扩大趋势，东起西太平洋岛屿，西到巴基斯坦边界，北起朝鲜，南到巴布亚新几内亚都已经成为乙脑的流行区。 我国DF和DHF的流行也有相当长的历史，甚至可以追溯到1873年。20世纪50年代以前我国沿海大部分地区均发生过DF，此后30多年未发生流行，直至1978年广东佛山再次发生登革4型流行，随后在沿海省份广东、广西和海南等省间断的流行至今。我国乙脑分布在除新疆、青海、西藏和东北北部外的所有省(自治区)。20世纪50～70年代乙脑呈现周期性流行，病例主要分布在东部沿海地区，70年代后，由于大规模使用乙脑疫苗，乙脑发病率明显下降，基本上控制了全国范围的流行。近年来，乙脑报告发病率基本控制在1/10万以下；但目前每年仍发生8,000～12,000左右乙脑病例，局部地区爆发或流行时有发生。 登革热的主要传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，一般认为，登革病毒主要感染人和低等灵长类动物。在城市型登革病毒感染循环中，病人和隐性感染者是主要传染源。在丛林型疫源地中，猴类动物是主要传染源。但是，也有人认为登革病毒的宿主尚未明确，而且登革热的发病有来无影去无踪的特点，除了人类和猴、猩猩、狒狒在内的低等灵长类动物外，有人报道从蝙蝠也分离到登革病毒。 蚊虫也是乙脑病毒的主要传播媒介，已报道从30多种不同的蚊虫体内分离出乙脑病毒，其中三带喙库蚊是最重要的传播蚊媒。一般认为，乙脑病毒存在于库蚊和野生水鸟之间的感染循环中，猪是重要的扩增宿主。但是一般来说虫媒病毒都有不只一种宿主，乙脑病毒还可以感染绵羊、家养的燕、猴子、金黄地鼠、小白鼠并可致病，还有报道从蝙蝠分离出乙脑病毒，表明其储存宿主范围广。 由于对登革热和乙脑的自然宿主范围尚未完全清楚，所以仍有必要进行深入的调查研究。全面掌握这两种疾病的流行病学特点，对于其预防和控制具有重要的意义。 蝙蝠是一个天然的病毒储存库，可以携带多种医学病毒，特别是近年发生的一些新发传染病被认为与蝙蝠有关。蝙蝠能否作为登革病毒和乙脑病毒的储存宿主?本研究拟通过调查广东和广西两个省(自治区)部分地区的蝙蝠是否携带登革病毒和乙脑病毒，了解蝙蝠作为登革病毒和乙脑病毒自然贮存宿主的可能性。 研究方法 1.标本处理2004年9月至2005年11月期间7次收集广东及广西部分地区的蝙蝠。收集的蝙蝠鉴定种类后解剖取脑组织标本和血清标本，脑组织标本加Hanks缓冲溶液用高压消毒过的微量研磨器无菌研磨，研磨液离心后取部分上清和血清标本分别进行RT-PCR和细胞培养分离方法检测，剩余标本放置-70℃保存。 2.细胞培养将脑组织研磨液上清和血清标本分别用含有每ml含有100单位青霉素和硫酸链霉素的Hanks缓冲溶液1∶10稀释，将已培养好长成单层的Vero细胞和C6/36细胞弃去原培养基，加入稀释好的接种液置于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱内吸附2h，然后弃去吸附液，加入含2％小牛血清的RPMI-1640培养基(Vero细胞)和DMEM培养基(C6/36细胞)继续培养。观察细胞变化，根据细胞形态变化判断病毒分离阴性或者阳性，若细胞形态有明显变化判断为阳性，如细胞圆缩、颗粒增多、融合成片，最后碎裂死亡，做进一步培养分离及分子生物学检测；若没有细胞形态变化做RT-PCR检测是否有病毒增殖，连续盲传三代，若仍未有形态变化且RT-PCR产物未扩增出目的基因片断就判断为阴性。 3.RT-PCR分别以DV和JEV病毒的NS1蛋白基因区和C/prM蛋白基因区为靶序列设计了两对通用RT-PCR引物，可同时检测出DV1～4型和JEV。先用Trizol核酸提取试剂提取脑组织研磨液和血清标本中的核糖核酸(RNA)，测定RNA浓度确定RNA提取成功；用M-MLV逆转录酶体系和随机引物进行逆转录(RT)合成cDNA；采用通用引物，以逆转录产物cDNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)检测所采集蝙蝠标本中的登革病毒和乙脑病毒。 结果 从2004年9月到2005年11月收集了4个科9个种共905只蝙蝠，其中：犬蝠395只、棕果蝠154只、普通长翼蝠5只、小黄蝠52只、中菊头蝠228只、中华菊头蝠15只、小菊头蝠41只、双色蹄蝠8只、普氏蹄蝠7只。食果蝙蝠数量最多，占检测总数的60.66％，犬蝠和棕果蝠分别占检测总数的43.65％和17.02％；食虫蝙蝠中以中菊头蝠数量最多，占检测总数的25.19％，其余6种蝙蝠共121只，只占检测总数的13.37％，均为食虫蝙蝠。蝙蝠的来源地分布于广东的怀集县、罗定市、广州市、惠州市和广西的贵港市、梧州市、藤县等7个县市。棕果蝠的栖息地以废弃和败落的房屋为主，犬蝠和小黄蝠为树栖性，普通长翼蝠、小菊头蝠、中华菊头蝠、双色蹄蝠和普氏蹄蝠均栖于洞穴。利用细胞培养分离方法和RT-PCR方法在905只蝙蝠标本中均未分离、检测到登革病毒和乙脑病毒。 结论 本研究未发现所调查的蝙蝠携带登革病毒和乙脑病毒，结果提示上述广东和广西部分地区蝙蝠携带登革病毒和乙脑病毒的量和携带率低。由于受所调查蝙蝠种类和数量不够多、蝙蝠的代表性不强；采集蝙蝠的时机与疾病流行季节不完全符合；检测方法灵敏度可能不够高的因素影响，还不能排除蝙蝠携带登革病毒和乙脑病毒以及作为其自然储存宿主的可能性。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章材料与方法

第三章结果

第四章讨论

全文小结

参考文献

综述一流行性乙型脑炎的病原学和流行病学研究进展

综述二登革热的研究进展

附录缩略语词汇表

硕士期间论文发表情况

致谢

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