叶酸受体介导肿瘤靶向N-软脂酰基壳聚糖纳米胶束的制备及实验研究

摘要

聚合物纳米胶束是一种多功能复合纳米粒子,它是利用两亲性嵌段共聚物与自组装技术制备而成,具有表面亲水、内部疏水的独特壳-核结构。利用聚合物纳米胶束进行疏水性药物和影像对比剂靶向传输及控制释放的研究已经成为一个热门领域。
　　 壳聚糖作为一种极其丰富的天然可再生资源,具有优越的生物相容性和生物降解性,在生物医药与生物材料领域有广阔应用前景,它所拥有的一些特殊性质使得它在药物制剂上也有广泛的应用。目前壳聚糖衍生物纳米胶束在包载药物、造影剂方面已有一些报道。
　　 肿瘤是严重威胁人类生命健康的常见病、多发病,肿瘤的靶向诊断及靶向治疗是针对肿瘤特异性分子靶点而设计的肿瘤诊治方案,具有特异性强、疗效显著及毒副作用小等特点,是一种极具应用前景的诊治模式。寻找特异性的分子靶点、设计及合成高度特异性的分子探针及药物靶向传输系统、利用分子影像学无创实时的监测肿瘤治疗效果是当前肿瘤诊治的研究热点。
　　 人类许多上皮来源的肿瘤细胞表面叶酸受体活性和数量显著高于正常组织细胞。叶酸与叶酸受体的结合能力强,能被高效介导进入肿瘤细胞,是一种极具应用潜能的靶向物质。叶酸受体不仅有望成为肿瘤影像诊断的新靶点,还有望成为肿瘤治疗的新靶点。
　　 目的：
　　 1.共价连接法制备叶酸修饰的PLCS纳米胶束(folate-N—palmitoyl chitosan,FPLCS),自组装技术包载SPIO(FPLCS nanoparticles with SPIO loading,FPLCS-SPIO),对以上产物进行结构、粒径、电位、外观特点表征。
　　 2.通过细胞实验初步研究FPLCS—SPIO的细胞毒性和体外靶向性。
　　 3.通过动物实验考察FPLCS.SPIO在体靶向成像效果、体内分布、动物毒性。
　　 方法：
　　 1.负载SPIO前后FPLCS纳米胶束的制备及表征:
　　 首先利用壳聚糖和N-软脂酰合成N-软脂酰基壳聚糖(N-palmitoyl chitosan,PLCS),将叶酸高效接枝在PLCS表面,红外光谱仪、核磁共振仪分别测定壳聚糖、PLCS、FPLCS、叶酸结构,然后利用自组装技术将SPIO负载于聚合物胶束的疏水性内核。
　　 FPLCS、PLCS胶束负载SPIO前后的表征包括:利用动态光散射仪(DLS)和透射电镜(TEM)测量胶束粒径大小及分布、表面电荷、形态,利用原子吸收法测量SPIO的负载率,测量FPLCS—SPIO、PLCS—SPIO(PLCS nanoparticleswith SPIO loading,PLCS-SPIO)载药胶束的磁学性质观察其是否具有超顺磁性,以MRI多回波SE序列测量T2弛豫时间,计算T2弛豫率等。
　　 2.将FPLCS-SPIO胶束、FPLCS胶束、PLCS-SPIO胶束分别与L-O2肝细胞共孵育24小时,利用四唑盐比色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)考察空白载体材料的细胞毒性,评价其安全性。
　　 将FPLCS-SPIO、PLCS-SPIO、SPIO分别与叶酸受体表达阳性的人宫颈癌细胞株HeLa细胞及叶酸受体表达阴性的人非细胞肺癌细胞株A549细胞共孵育8小时,普鲁士蓝染色观察FPLCS-SPIO体外靶向效能；Dil标记的FPLCS—SPIO与HeLa细胞和A549细胞共孵育8小时,共聚焦显微镜扫描进一步观察FPLCS-SPIO体外靶向效能及细胞内分布。
　　 3.动物实验:
　　 建立裸小鼠荷人宫颈癌及人非小细胞肺癌皮下移植瘤动物模型,将36只裸小鼠随机分成6组,每组6只,3组荷人宫颈癌皮下移植瘤,3组荷人非小细胞肺癌皮下移植瘤,约2-4周当肿瘤直径达0.8 cm以上时,对裸小鼠进行MRI扫描,按分组要求,实验组经尾静脉注射FPLCS-SPIO,对照组经尾静脉注射PLCS—SPIO或SPIO,注射剂量均为2 mg Fe/kg。注射前及注射后不同时间点(1h、4h、8h)分别进行MRI成像,测量感兴趣区(肿瘤、肌肉组织)T2WI信号强度,计算信号变化率,最后用SPSS12.0统计软件进行统计、分析。
　　 病理组织学检查:包括常规HE染色和普鲁士蓝染色。
　　 DiI标记的FPLCS-SPIO分别经尾静脉注入裸小鼠荷人宫颈癌及人非小细胞肺痛皮下移植瘤动物模型,8小时后处死动物,取组织冰冻切片荧光显微镜观察FPLCS—SPIO组织分布。
　　 FPLCS—SPIO注入昆明鼠体内,对FPLCS—SPIO的在体安全性进行初步评价。
　　 结果：
　　 1.成功制备负载SPIO的叶酸靶向N-软脂酰基壳聚糖纳米胶束和非叶酸靶向N-软脂酰基壳聚糖纳米胶束并对其进行表征,DLS和TEM显示所制备的胶束符合纳米尺寸、均匀性好。Zeta电位测定示胶束表面呈正电荷,原子吸收法显示SPIO负载效率高,磁学曲线、弛豫率测定结果显示胶束具有超顺磁性。
　　 2.细胞毒性试验显示叶酸靶向N-软脂酰基壳聚糖纳米胶束包载SPIO后明显减低SPIO的毒性,胶束本身几乎无细胞毒性。普鲁士蓝染色显示FPLCS-SPIO与HeLa细胞共孵育后,细胞内大量铁存在；PLCS-SPIO、SPIO与HeLa细胞共孵育后细胞内只有极少量铁呈点状存在,FPLCS-SPIO、PLCS-SPIO、SPIO与A549细胞共孵育后细胞内也只有极少量铁存在。
　　 3.动物实验:
　　 成功建立荷人宫颈癌及人非小细胞肺癌裸小鼠皮下移植瘤动物模型。在体MRI成像结果显示,注射FPLCS—SPIO后人宫颈癌肿瘤部位不同时点的T2WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学差异(F=38.76,P=0.000)。而非靶向组在注射后1h、4h、和8h三个时间点的信号亦有轻度下降,但信号下降幅度较叶酸靶向组低,且持续时间短。
　　 病理学检查:HE染色证实所建立的裸小鼠动物模型符合人宫颈癌及人非小细胞肺癌组织学特征。普鲁士蓝染色显示注入FPLCS-SPIO后人宫颈癌肿瘤组织内有较多蓝染的铁颗粒,而非靶向组则几乎未见铁颗粒的存在。
　　 荧光显微镜观察显示DiI标记的FPLCS-SPIO主要分布于人宫颈癌肿瘤组织中,肾、肝、脾、人非小细胞肺癌肿瘤可见中等量的分布,肺、卵巢、小肠和脑组织中只有极少量荧光分布。
　　 在体的初步安全性评价提示负载SPIO的FPLCS对裸小鼠无明显急性毒副作用,安全性较高。
　　 结论：
　　 1.通过共价连接法可成功将叶酸分子接枝在PLCS上,所得FPLCS为水脂两亲性材料,在水溶液中可自组装成纳米胶束并可成功包载疏水性SPIO。
　　 2.FPLCS-SPIO对于表达叶酸受体的细胞具有良好的靶向性,且对细胞几乎无毒性。
　　 3.FPLCS-SPIO注入动物体内后可靶向于叶酸受体阳性的肿瘤组织,使肿瘤局部MRI成像信号明显减低,分布范围窄,对动物毒性小。