基于ITS区多态性的柴胡类生药鉴定用DNA芯片的研究

摘要

常用中药柴胡(Radix Bupleuri)已有2000多年的应用历史,其来源为伞形科柴胡属植物柴胡(北柴胡,Bupleurum chinense)和狭叶柴胡(南柴胡,B.scorzonerifolium)的干燥根,对治疗流感、发烧、肝炎、疟疾和月经不调有明显疗效。全世界已报道的柴胡属植物约有150种,我国分布42种、17变种、7变型。据调查,其中有36种(变种、变型)在不同地区和市场作为柴胡使用,包括有毒的大叶柴胡和含活性成分很低的小柴胡等；有的地区,甚至把当地所产5、6种柴胡混在一起使用,造成市场混乱,药材质量极不稳定。这就迫切要求对柴胡进行准确的鉴定,以确保其质量与安全。
　　 目前,柴胡的鉴定主要依靠形态学特征或其中的化学成分柴胡皂苷a、d的检查,然而,由于同属植物来源的生药形态和显微特征极近似,以及化学成分在植物发育和收获后加工过程中可能会有很大的变化,使得用传统方法对柴胡进行鉴定存在相当的难度,因此,有必要建立更客观、准确、实用而简便的方法。
　　 核糖体DNA的内转录间隔区ITS(internal transcribed spacer)区具有较多的碱基信息,在长度上具有较好的保守性,特别适合于植物属、组级的系统发育和分类研究；通过对ITS区的测序及序列间的相互比较,可以对柴胡品种进行区分,确定其来源。
　　 此外,过去几年中,基因芯片已被证明是一种可行的生药鉴定技术。由于国内几乎所有的基层结构都没有测序仪,有时测序费用也会显得比较昂贵,因此,在ITS序列多态性研究的基础上,针对不同植物来源的柴胡类生药,可制备用于其鉴别的寡核苷酸基因芯片。
　　 目的：鉴于ITS序列及基因芯片在生药鉴定中的可行性,本论文拟收集分布广泛,品种较多的柴胡类生药标本,对其展开ITS序列及基因芯片的研究,寻找柴胡类生药更准确、简便的鉴定方法。
　　 内容：
　　 1.野外采集柴胡标本,对柴胡在国内的资源分布进行考察。
　　 2.对收集的柴胡类生药样本提取总DNA,完成ITS序列进行扩增测序、数据分析,对ITS序列鉴定柴胡品种的可行性进行评价。
　　 3.在ITS序列多态性研究的基础上,针对6种不同植物来源的柴胡类生药,制备用于其鉴别的寡核苷酸基因芯片,探讨基因芯片运用于柴胡类生药鉴定的方法和前景。
　　 方法：
　　 1.标本采集本研究中需要大量来源清晰、经正确鉴定的柴胡类植物标本与生药样品,获得的主要途径包括:
　　 1)野外采集；
　　 2)前期工作中采集和收集的标本与样品,特别是利用国内各标本馆中所藏柴胡属植物标本,如收藏柴胡属植物标本较多的复旦大学药学院标本馆、华南植物所标本馆等；
　　 2.DNA提取及ITS扩增
　　 1)采用植物基因组提取试剂盒对18种柴胡属植物提取总DNA,用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测模板质量；
　　 2)对所提取的DNA的ITS序列扩增,引物采用5P、4P双引物进行扩增,引物序列分别为:
　　 “ITS5P”-5'>GGAAGGAGA AGTCGTAACAAGG<3',“ITS4P”-5'>TCCTCCGCTTATTGATATGC<3'。
　　 反应体系25μl:10×PCR反应缓冲液2.5μl,dNTP(各2.5 mmol/L)1μl,Taq酶1 U,引物(20μmol/L)各1μl,基因组DNA50-75 ng,加去离子水至25μl。
　　 反应程序:93℃5 min,55℃2 min；93℃30 s,55℃45 s,70℃45 s,循环35次；70℃5min。
　　 3.PCR产物回收、纯化及测序PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen)回收,1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后,由上海英俊工程有限公司测序部测序,各样品均采用正向及反向双向测序。
　　 4.序列比对及分析以柴胡属近缘植物伞形科阿米芹族葛缕子亚族毒芹属植物毒芹Cicuta virosaL.为外类群,与柴胡ITS序列进行分析。DNA序列的排序用Clustal X软件完成。ITS1、5.8S和ITS2的边界参照GenBank中发表的柴胡属植物的ITS序列进行划分。排序后的序列使用MEGA4.0分子进化遗传分析软件,采用K-2p参数遗传距离(kimura-2parameter genetic distance),邻接法(neighbor joining method)构建NJ系统树；系统树各分支的置信度用自举检验法(bootstraptest)检验,共进行1000次循环。
　　 5.DNA芯片探针设计考察不同柴胡ITS序列之间的差异,确定了各个种特异的多态性位点。根据这些多态性位点,为每种柴胡设计一条或多条引物用于其鉴定。
　　 6.DNA芯片制备制备的各探针及阳性对照、空白对照溶液各取10μL,加样于384孔微孔板上,用装配MicroQuill2000针头的OmniGrid100微阵列点样器打印于玻璃基板上。打印完毕的芯片在微阵列点样器中放置30min,然后于室温干燥30min。用B1清洗液冲洗5min后,双蒸水冲淋,并于室温下干燥。
　　 7.标记
　　 200μLPCR反应管中进行标记反应。标记反应引物如下:
　　 “ITSlA”-5’>GGATATCCGTTGCCGAGAGT<3’,“ITS5P”-5’>GGAAGGAGAAGTCGTACAAGG<3’。
　　 标记反应体系40μL:d(AGT)TP250μmol·L-1,dCTP25μmol·L-1,Cy5-dCTP2·5μmol·L-1,引物各0.6μmol·L-1,rTaq聚合酶2U,Mg2+2.5mmol·L-1,10×PCR缓冲液4Ml,基因组DNA50～100ng,加去离子水至40μL。
　　 标记反应程序:93℃5min,55℃2min；93℃30s,55℃45s,70℃45s,循环35次;70℃7min,4℃保存。
　　 标记产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
　　 8.杂交、扫描将7μL2×杂交缓冲液、7μL荧光标记的PCR产物与1μL阳性对照引物CCOB(5’-Cy5-CCAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTT-3’)混合,于95℃变性2min,立即冰浴冷却用移液管将其转移至芯片目标区域,盖上盖玻片,55℃杂交2h。杂交完成后,先后以0.2％SDS和水冲洗芯片,放置微干。ScanArray4000芯片扫描仪检测荧光信号。
　　 结果：
　　 1.ITS序列
　　 1)18种柴胡属植物的ITS序列长度范围599-609bp,G+C％含量为55.9％-59.3％；ITS1区长度最大相差7bp,G+C％含量为59.8％-64.5％；5.8s rDNA序列长度范围稳定在162-163bp,其中有10种柴胡属植物G+C％含量为53.4％;ITS2区长度最大相差4bp,G+C％含量为54.2％-60.8％；ITS1区的G+C％含量高于ITS2区。
　　 2)当空位(Gap)作为缺失处理时,ITS区全序列排序后的长度为609位点,其中168个变异位点,90个信息位点。5.8S rDNA变异较小,保守位点占85.3％,ITS区的变异主要发生在内转录间隔区ITS1和ITS2区。ITS1、ITS2区的变异位点为80和64,信息位点分别为21.6％和16.7％,而5.8S rDNA序列中仅有5个信息位点,所以5.8S rDNA区相对保守。内转录间隔区(ITS1+ITS2)对位排列后总长度为446bp,共有144个变异位点,85个信息位点,信息位点比例达到19.1％。
　　 3)18种柴胡的遗传距离为0.002-0.159。其中云南采集的竹叶柴胡、窄竹叶柴胡、小柴胡和细茎有柄柴胡与其它柴胡的遗传距离为0.091-0.159,新疆采集的金黄柴胡与其它柴胡之间遗传距离为0.071-0.159。毒芹与柴胡属植物遗传距离为0.341-0.406。
　　 4)聚类分析结果:柴胡属与毒芹属分化明显,各自为一单系树；多枝柴胡与柴首聚在一起；南方大叶柴胡与大叶柴胡聚在一起；黑柴胡与小叶黑柴胡聚在一起；马尔康柴胡与四川柴胡、银州柴胡、北柴胡聚类；窄竹叶柴胡与竹叶柴胡、小柴胡、细茎有柄柴胡聚类。
　　 2.DNA芯片不同地点采集的同一种柴胡样品,其杂交图谱相同。在某些情况下,除预期的探针位置外,其他探针的位置也会出现信号。以北柴胡为例,在其杂交图谱中,探针Sa2和Sa4处同时出现了荧光斑点,但只有Sa2是为其设计的,Sa4是为银州柴胡设计的,说明有交叉反应出现,本实验中,每种柴胡都可以通过杂交图谱得以鉴别,银州柴胡可以通过Sb1处的信号与北柴胡区别开。
　　 结论：
　　 1.18种柴胡品种的ITS序列之间有差异,ITS序列对柴胡类生药的鉴定具有可行性；
　　 2.研制的DNA芯片可为柴胡类生药的鉴定提供可靠便利的途径。