PRL-3参与结直肠癌侵袭转移的表观遗传学机制:PRL-3与Histone H3的新联系

摘要

越来越多的研究表明,促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regeneratingliver-3,PRL-3)与人结直肠癌的发生、进展、转移及预后密切相关,但迄今为止,PRL-3的底物、其促进结直肠癌发生发展的机制以及它所参与的信号途径仍未明确。PRL-3属于蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase)家族(PRL-1、PRL-2、PRL-3)成员,它发挥作用的重要方式是通过调节酪氨酸残基的磷酸化状态实现对蛋白质活性的调控。
　　 课题组前期通过酵母双杂交技术及免疫共沉淀方法筛选并证实PRL-3相互作用蛋白CDH22,在此研究的基础上我们提出了PRL-3参与EMT过程的重要机制。
　　 近期课题组应用功能蛋白组学的研究策略获得PRL-3相关信号网络的新组份,我们发现了一群重要的功能蛋白与PRL-3关系密切,并对PRL-3与Stathmin的相互关系进行了研究。有意思的是在我们发现的PRL-3功能相关蛋白群中PSMD14、UBE2V1、JMJD2B、RUFY1、eIF5A、Cofilin2、BIN1、JMJD1B、PLEC1、PSMA6、CEP290等与细胞核内相关信号的调节有关。其中JMJD1B(又称为KDM3B,lysine(K)-specific demethylase3B)和JMJD2B(又名KDM4B,Lysine-specific demethylase4B)是一种组蛋白去甲基化酶,它特异性地作用于组蛋白Histone H3第9位赖氨酸(Lys-9)残基使其去甲基化,在“组蛋白密码”(Histone code)中发挥核心作用。
　　 JMJD家族为组蛋白去甲基化酶,主要存在于细胞核内,其催化活性需要Fe2+和α-酮戊二酸的参与,可催化Histone H3多个位点赖氨酸的去甲基化修饰,从而调节了特定基因的表达。JMJD家族催化的去甲基化与精子发育、肿瘤发生及其他疾病发生存在密切关系。
　　 由于JMJD家族为核蛋白,为了进一步确定PRL3与JMJD家族之间的关系,我们首先通过免疫荧光、Western Blot等确定PRL-3可以存在于结直肠癌细胞核内,核内PRL-3的存在提示PRL-3在基因调节中的重要作用,同时我们观察到PRL-3可以调节JMJD家族中的JMJD1B与JMJD2B的表达,其中PRL-3与JMJD1B负相关,PRL-3与JMJD2B正相关。基于JMJD是组蛋白去甲基化酶,JMJD1B特异性催化H3K9去甲基化,JMJD2B也可以促进H3K9的甲基化,进一步我们观察到,PRL-3可以通过JMJD家族调控H3K9甲基化。这一研究初步建立了PRL-3与Histone H3甲基化修饰之间的功能联系。
　　 有趣的是,在我们随后通过免疫共沉淀方法及质谱鉴定获得的与PRL-3可能有直接相互作用的10种蛋白中,我们发现组蛋白H3是其中的成员之一。组蛋白H3,分子量大小约17KD,有着一个主要的球状结构域与长的N端尾链,是组成核小体的基本功能单位之一。它的N端尾链从球状核小体核心伸出,容易发生各种表观遗传修饰,从而对相关基因的表达调控发挥作用。本研究通过免疫共沉淀结合免疫荧光共定位方法等证实了PRL-3与Histone H3直接相互作用,并应用生物信息学预测对两者之间的具体磷酸化作用方式进行分析。
　　 本研究初步建立PRL-3和Histone H3直接和间接的功能联系。
　　 方法
　　 1、PRL-3与JMJD家族相关,并通过JMJD家族调控Histone H3K9甲基化结直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo细胞及结直肠癌组织中,免疫荧光分析PRL-3在结直肠癌细胞与组织内的定位。
　　 将结直肠癌细胞株SW480、SW620中PRL-3敲低,免疫荧光标记后共聚焦分析对JMJD1B和JMJD2B在结直肠癌细胞内表达的影响；结直肠癌组织免疫荧光标记后共聚焦分析PRL-3与MJD1B、JMJD2B在结直肠癌组织内的共定位关系；Western Blot检测在结直肠癌细胞SW620、LoVo细胞中PRL-3干扰后对JMJD1B与JMJD2B蛋白表达水平的影响。
　　 将结直肠癌细胞株SW620中PRL-3干扰,免疫荧光标记后共聚焦分析对Histone H3(Lys9)单甲基化、二甲基化、三甲基化、全甲基化在结直肠癌细胞内表达的影响；Western Blot检测结直肠癌细胞株SW620、LoVo中PRL-3干扰后对Histone H3(Lys9)单甲基化、二甲基化、三甲基化、全甲基化蛋白表达的影响；将结直肠癌细胞株LoVo中JMJD1B或JMJD2B干扰,免疫荧光标记后共聚焦分析对Histone H3(Lys9)单甲基化、二甲基化、三甲基化及全甲基化在结直肠癌细胞内表达的影响；Western Blot检测JMJD1B或JMJD2B干扰后对结直肠癌细胞株SW620、LoVo中Histone H3(Lys9)单甲基化、二甲基化、三甲基化、全甲基化蛋白表达的影响。
　　 2、JMJD家族在结直肠癌中作用及意义
　　 结直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo及结直肠癌组织免疫荧光标记后共聚焦分析JMJD1B和JMJD2B在结直肠癌组织及细胞内的定位；Western Blot检测JMJD1B与JMJD2B在结直肠正常与癌配对组织内的表达；Western Blot检测JMJD1B与JMJD2B在结直肠癌细胞内的表达。
　　 利用MTT法、平板克隆形成实验检测JMJD1B或JMJD2B干扰后对结直肠癌细胞SW480、SW620、LoVo体外增殖能力的影响；应用运动小室、划痕实验检测JMJD1B或JMJD2B干扰后对结直肠癌细胞SW620、LoVo运动和迁移能力的影响；流式细胞术检测JMJD1B或JMJD2B干扰后对结直肠癌细胞SW620、LoVo细胞凋亡及LoVo细胞周期的影响。
　　 免疫组织化学化检测JMJD1B和JMJD2B在结直肠癌组织内的表达。
　　 3、免疫共沉淀筛选PRL-3直接相互作用蛋白并验证两者相互作用
　　 生长状态良好的人结直肠癌细胞株SW480、LoVo及新鲜结直肠癌组织提取全蛋白,免疫球蛋白IgG作为阴性对照,行免疫共沉淀技术筛选PRL-3直接相互作用蛋白,通过MALDI-TOF MS分析鉴定相关蛋白。
　　 通过免疫共沉淀从正反两方面验证PRL-3与Histone H3存在直接相互作用；生长状态良好的人结直肠癌细胞株LoVo及结直肠癌组织免疫荧光标记后共聚焦分析PRL-3与Histone H3在结直肠癌内的共定位。
　　 提取新鲜结直肠癌组织全蛋白,Western Blot检测结直肠癌组织中PRL-3与组蛋白H3的表达,初步确定PRL-3与组蛋白H3在结直肠癌组织中表达的关系;Western Blot检测PRL-3上调、下调后对结直肠癌细胞SW480、SW620、LoVo内Histone H3蛋白表达的影响；免疫组织化学分析组蛋白H3在结直肠癌组织内的表达。
　　 4、PRL-3与Histone H3相互作用方式分析
　　 结直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo细胞中分别将PRL-3干扰、过表达后,收取转染18h、24h、36h后新鲜细胞蛋白,Western Blot检测磷酸化HistoneH3(Ser10)表达水平；结直肠癌细胞株LoVo、结直肠癌组织免疫荧光标记后共聚焦分析PRL-3与磷酸化Histone H3(Ser10)在结直肠癌内的共定位；利用生物信息学根据PRL-3与Histone H3结构特点,预测PRL-3与Histone H3可能相互作用区域。
　　 结果
　　 1、PRL-3与JMJD家族相关,并通过JMJD家族调控Histone H3K9甲基化在对结直肠癌细胞株LoVo、SW480、SW620中PRL-3免疫荧光定位时我们观察到,PRL-3在LoVo细胞中不但定位于胞浆,而且在细胞核内也有较强荧光表达。在SW480、SW620中主要定位于胞浆,胞核内弱表达。在结直肠癌组织冰冻切片免疫荧光标记后,PRL-3除在胞浆内表达,在细胞核内也有强表达。Western Blot检测进一步证实PRL-3在结直肠癌细胞LoVo、SW480、结直肠癌组织核蛋白内有表达。
　　 将结直肠癌细胞株SW480、SW620中PRL-3干扰后,免疫荧光结果显示JMJD1B荧光强度升高,JMJD2B荧光强度降低；结直肠癌细胞株SW620、LoVo中,Western Blot检测PRL-3干扰后发现JMJD1B表达量升高,JMJD2B表达量降低。
　　 将结直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo中PRL-3干扰后,免疫荧光显示Histone H3(Lys9)单甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lys9)二甲基化荧光强度增强,Histone H3(Lys9)三甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lyrs9)全甲基化荧光强度降低；Western Blot检测发现结直肠癌细胞株SW620、LoVo中PRL-3干扰后Histone H3(Lys9)单甲基化蛋白表达量降低,Histone H3(Lys9)二甲基化蛋白表达量增强,Histone H3(Lys9)三甲基化蛋白表达量降低,HistoneH3(Lys9)全甲基化蛋白表达量降低,与免疫荧光结果相一致。
　　 结直肠癌细胞株LoVo中将JMJD1B干扰后,免疫荧光显示Histone H3(Lys9)单甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lys9)二甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lys9)三甲基化荧光强度增强,Histone H3(Lys9)全甲基化荧光强度增强；Western Blot检测发现结直肠癌细胞株SW620、LoVo中JMJD1B干扰后,HistoneH3(Lys9)单甲基化蛋白表达量降低,Histone H3(Lys9)二甲基化蛋白表达量降低,Histone H3(Lys9)三甲基化蛋白表达量增强,Histone H3(Lys9)全甲基化蛋白表达量增强,与免疫荧光结果相一致。
　　 将结直肠癌细胞株LoVo中JMJD2B干扰后,免疫荧光显示Histone H3(Lys9)单甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lys9)二甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lys9)三甲基化荧光强度降低,Histone H3(Lys9)全甲基化荧光强度降低；Western Blot检测发现结直肠癌细胞株SW620、LoVo中JMJD1B干扰后,HistoneH3(Lys9)单甲基化蛋白表达量降低,Histone H3(Lys9)二甲基化蛋白表达量降低,Histone H3(Lyrs9)三甲基化蛋白表达量降低,Histone H3(Lys9)全甲基化蛋白表达量降低,与免疫荧光结果相一致。
　　 2、JMJD家族在结直肠癌中的作用及意义
　　 直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo及结直肠癌组织中JMJD1B、JMJD2B免疫荧光显示其主要定位于细胞核内；
　　 Western Blot检测发现JMJD1B在结直肠癌组织内表达低于正常组织,JMJD2B在结直肠癌组织内高表达于正常组织;在结直肠癌细胞内,JMJD1B在SW620、SW480内高表达,JMJD2B在SW620、LoVo细胞内高表达。
　　 MTT法检测结果表明,经析因方差分析,LoVo细胞内JMJD1B干扰、JMJD2B干扰与对照组相比差异具有显著性(F=3719.139,P<0.001)；不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=8665.950,P<0.001)；各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(F=453.379,P<0.001)；除第1天(F=1.493,P=0.298)、第2天(F=0.755,P=0.510)外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。JMJD1B及JMJD2B敲低后,细胞的增殖速度减慢。SW620细胞内JMJD1B干扰、JMJD2B干扰与对照组相比差异具有显著性(F=23944.241,P<0.001)；不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=56323.638,P<0.001)；各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(F=5069.047,P<0.001)；除第1天(F=0.603,P=0.577)外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。JMJD1B敲低及JMJD2B敲低后,细胞的增殖速度减慢。SW480细胞内JMJD1B干扰、JMJD2B干扰与对照组相比差异具有显著性(F=189.319,P<0.001)；不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=1125.642,P<0.001)；各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(F=33.879,P<0.001)；除第1天(F=1.352,P=0.327)、第2天(F=0.524,P=0.617)外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性。JMJD1B及JMJD2B敲低后,细胞的增殖速度减慢。
　　 平板克隆形成实验经One-Way ANOVO分析,显示LoVo shRNA-JMJD1B细胞、shRNA—JMJD2B细胞与对照组细胞相比克隆形成能力下降,具有显著性差异(F=84.419,P<0.001):SW620 shRNA—JMJD1B、shRNA-JMJD2B细胞与对照组细胞相比克隆形成能力下降,具有显著性差异(F=266.886,P<0.001),SW480 shRNA-JMJD1B、shRNA-JMJD2B细胞与对照组细胞相比克隆形成能力下降,具有显著性差异(F=220.486,P<0.001)。
　　 Transwells小室实验经One-Way ANOVO分析证明,与LoVo细胞相比,LoVoshRNA-JMJD1B、shRNA-JMJD2B细胞的迁移能力下降,具有显著性差异(F=368.832,P<0.001)；与SW620相比,SW620 shRNA-JMJD1B、shRNA-JMJD2B细胞的迁移能力下降,具有显著性差异(F=234.842,P<0.001)。
　　 划痕实验经One-Way ANOVO分析证明,与LoVo细胞相比,LoVoshRNA-JMJD1B、shRNA-JMJD2B细胞的迁移能力下降,具有显著性差异。
　　 免疫组织化学结果分析表明,在结直肠癌组织内,JMJD1B主要表达于细胞核内；JMJD1B正常结直肠组织表达高于结直肠癌组织；JMJD1B蛋白的表达与病人的淋巴结状态(P=0.032)、Dukes分期(P=0.008)和TNM分期(P=0.022)有关,差异具有显著。在结直肠癌组织内,JMJD2B主要表达于细胞核内；JMJD2B正常结直肠组织表达低于结直肠癌组织(p<0.001)；JMJD2B蛋白的表达与病人的淋巴结状态(P=0.030)、Dukes分期(P=0.036)和肿瘤的浸润深度(p=0.003)有关,差异具有显著。
　　 3、免疫共沉淀筛选PRL-3直接相互作用蛋白并验证两者相互作用
　　 免疫共沉淀后与阴性对照组IgG相比,得到10条有差异蛋白条带,将这10条带通过MALDI-TOF MS分析鉴定相关蛋白,得到10种可能有相互作用蛋白。其中第9号蛋白为Histone H3。
　　 免疫共沉淀分析结果表明,在不同结直肠癌细胞株和不同结直肠癌组织中PRL-3与Histone H3存在直接相互作用；在结直肠癌细胞株LoVo、结直肠癌组织中免疫荧光显示PRL-3与Histone H3存在共定位关系；Western Blot检测发现在8例结直肠癌组织中PRL-3蛋白表达量高的组织中,Histone H3的表达也高；PRL-3蛋白表达量低的组织中,Histone H3的表达也低；在结直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo中,将PRL-3干扰后,Histone H3的表达量比对照组低,PRL-3过表达后,Histone H3的表达量比对照组高;LoVo细胞中这种关系比SW480、SW620更明显。说明PRL-3与Histone H3正相关。
　　 免疫组织化学结果分析表明,Histone H3表达的高低与病人的性别、年龄、肿瘤的大小与位置、肿瘤的分化及肿瘤的浸润深度没有显著差异性(P>0.05),但是Histone H3蛋白的表达与病人的淋巴结状态(P<0.001)和Dukes分期(P<0.001)有关,差异具有显著性。
　　 4、PRL-3与Histone H3相互作用方式分析
　　 结直肠癌细胞株SW480、SW620、LoVo细胞中将PRL-3干扰、过表达后,收取转染18h、24h、36h后新鲜细胞蛋白,Western Blot检测磷酸化Histone H3(Ser10)蛋白表达量无明显变化；结直肠癌细胞株LoVo、结直肠癌组织免疫荧光分析PRL-3与磷酸化Histone H3(Ser10)无明显共定位；利用生物信息学根据PRL-3与Histone H3结构域特点对其相互作用预测,得到三段可能相互作用区域。
　　 结论
　　 1.我们在前期获得PRL-3相关核功能蛋白的基础上发现,PRL-3可以通过JMJD家族成员JMJD1B和JMJD2B调节H3K9甲基化水平；PRL-3与JMJD1B负相关,PRL-3与JMJD2B正相关；JMJD1B抑制结直肠癌发生发展,JMJD2B促进结直肠癌发生发展。PRL-3与JMJD家族成员JMJD1B和JMJD2B的功能联系确定了PRL-3调控Histone H3甲基化的间接方式。
　　 2、我们应用免疫共沉淀及质谱鉴定筛选出PRL-3直接相互作用蛋白,Histone H3是其中重要的候选蛋白,进一步的研究证实PRL-3与Histone H3存在直接相互作用,生物信息学预测表明Histone H3存在三个可能区域与PRL-3相互作用,PRL-3调节Histone H3磷酸化的方式并不是通过调节Ser10磷酸化,PRL-3调控Histone H3磷酸化的直接方式还有待进一步阐明。