氧疗对胎鼠宫内生长受限的治疗作用及其对孕鼠血液系统影响的实验研究

摘要

研究背景:胎儿生长受限(Fetal Growth Restriction,FGR),曾称为胎儿宫内发育迟缓(Intrauterine Growth Retardation,IUGR),是指孕37周后,胎儿出生体重小于2500g；或低于同孕龄平均体重的两个标准差；或低于同孕龄正常体重的第10百分位数。发达国家FGR的发生率约为2％～3％,我国的发病率平均为6.39％,是围生期主要并发症之一。FGR围生儿病死率为正常儿的4～6倍,在死亡中约占围生儿的30％,产时宫内缺氧围生儿中50％为FGR患儿。FGR不仅影响胎儿的发育,也影响儿童期及青春期的体能与智能发育,其病因多样而复杂,包括孕妇因素、胎儿因素和胎盘因素,其中有40％的患者原因不明。FGR可导致胎儿畸形、早产、足月低出生体重儿增加,引起围生儿发病率、死亡率升高,还可导致远期并发症如神经系统发育障碍、智力低下,成年后冠心病、高血压以及糖尿病的发生率增加。因此,及时有效地治疗FGR是改善围产儿预后的关键,随着围产医学的发展,人们愈加重视对FGR的防治。除常规治疗外,已有报道用高压氧治疗FGR效果明显,但是由于有高压氧疗压力高于常压容易发生氧中毒以及时间长、疗程长等弊端,加压、减压可能对孕妇或胎儿造成不良反应。因此孕期高压氧疗在临床并未广泛应用,那么常压氧和低流量吸氧是否对FGR有治疗作用及氧疗对孕鼠的影响,这些都有待进一步研究。
　　 在高压(超过常压)的环境下,呼吸高浓度氧以治疗某些疾病的方法,即高压氧治疗,高压氧治疗是一种特殊的氧疗方法,它具备常压环境下一般氧治疗所不能达到的治疗作用。临床已经发现,高压氧对先兆流产、妊娠高血压疾病、胎儿生长受限等均有良好的治疗作用。
　　 常压高浓度氧疗简称常压氧,又称舱外高流量给氧,即高流量脉冲式给氧,在常压环境面罩或吸氧头罩呼吸高浓度、高流量的氧,高氧流量8L～10 L/min,浓度可达80％～99％,有报道常压氧疗在胎儿窘迫、胎儿心律失常、胎盘功能下降、胎儿三尖瓣反流的治疗中取得较好效果。
　　 有实验证明高压氧会给妊娠后期胎儿和新生儿视网膜造成损坏,导致早产儿和新生儿视网膜病变,称眼型氧中毒,阻碍了高压氧疗在产科和儿科的推广。那么常压氧疗能否对FGR有治疗作用,如果有治疗作用,效果如何,能否代替高压氧疗,但常压氧疗法的安全性、剂量、持续时间及频率问题仍有待进一步研究,且常压氧用于胎儿宫内治疗的理论机制尚不明确,目前尚缺乏临床应用的循证医学证据。因此,本课题拟通过研究三种不同氧疗方式对孕鼠的影响及其对胎鼠出生体重和胎鼠FGR发生率、胎鼠死亡率等方面的影响,以确定其对FGR是否有一定的治疗作用及其作用机制。
　　 研究目的:建立胎儿生长受限动物模型,给予胎儿生长受限的孕鼠以不同氧疗方式处理,观察胎鼠出生体重、胎盘结构及重量变化情况,计算胎鼠的FGR发生率、胎鼠死亡率,孕鼠孕期生长状况,检测孕鼠在氧疗前后血液粘度相关指标,探索常压氧及普通低流量吸氧治疗胎儿生长受限的可行性及疗效,探讨其是否能改善孕鼠血液粘度从而起到治疗作用,为临床上应用氧疗治疗胎儿生长受限进行前期动物实验研究。
　　 材料和方法
　　 1.选用SPF级2月龄～3月龄、240g～280g雌性无交配史SD大鼠,每天18:00对雌鼠进行阴道涂片,选取处于动情前期或动情期的雌鼠,按雌雄比2:1合笼,第二天清晨阴道涂片发现精子则判定为已交配,计为妊娠第2天。
　　 2.制作FGR模型实验:摸索孕鼠双侧子宫血管结扎的最佳时间和方式。
　　 32只大鼠随机分为4组,每组8只,对照组大鼠孕期不做任何处理,A组在孕12d,B组在孕14d,C组在孕16d时麻醉后行双侧子宫动静脉部分结扎术,均以0.3％戊巴比妥腹腔麻醉,按1ml/100g给药,自腹中线打开腹腔,暴露双侧子宫,A组以2-0号肠线作衬垫、B组和C组以3-0号肠线作衬垫,均以3-0号丝线结扎子宫血管,然后抽出肠线,将子宫放回腹腔,取出另一侧子宫角,同上法操作,4号丝线连续缝合腹部切口,关闭腹腔。所有大鼠均在孕21d剖宫产娩出胎鼠。孕鼠每周称重1到2次,剖宫取胎后胎鼠及胎盘称重。
　　 3.氧疗对宫内生长受限胎鼠的治疗作用及其对孕鼠血液系统影响的动物实验:
　　 将96只雌性SD大鼠随机分为六组,每组各16只。①空白对照组:孕期不予任何处理；②假手术对照组；③单纯造模组；④高压氧疗组；⑤常压高浓度氧疗组；⑥常压低浓度氧疗组。③④⑤⑥组均采用同一方法建立胎儿生长受限模型,④组术后接受高压氧治疗,⑤组术后接受常压高浓度氧治疗,⑥组术后接受常压低浓度氧治疗。孕鼠每周称重1～2次,六组孕鼠分别在妊娠第12d和第21d各处死8只,处死前心脏采血,检测血流变指标,孕21d剖宫取胎测定胎鼠、胎盘重量。取胎盘10％中性福尔马林液中固定过夜,常规石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(Hematoxylin-Yihong,HE)染色。
　　 结果
　　 1.孕鼠FGR动物模型的确定造模的三个实验组及对照组孕鼠均于妊娠第21d剖宫取胎,0.3％戊巴比妥麻醉后开腹,暴露子宫,剪开子宫肌层,刺破胎膜,断脐,擦干胎鼠身上的羊水及血液,测定胎鼠、胎盘重量。对照组胎鼠平均出生体重和胎盘重量均大于其他三组(P<0.01)。在三个实验组中,实验A组胎鼠出生体重和胎盘重量明显低于其他两组,实验C组胎鼠出生体重和胎盘重量最大。全部四组组间两两相比,胎鼠和胎盘平均重量均有差异(P<0.01)。实验A组胎鼠的FGR发生率(83.1％)最高,对照组最低,四组之间亦有统计学差异(P<0.01)。四组胎鼠死亡率由高到低为实验A组11.27％,实验B组8.70％,实验C组4.11％,对照组1.33％,四组之间死亡率无统计学差异(P=0.06)。
　　 2.氧疗对FGR孕鼠体重及血液粘度的影响
　　 (1)对照组和假手术组孕鼠孕期体重持续稳定增长；六组孕鼠在孕12d结扎前体重均无差异(P>0.05)。孕14d时后四组孕鼠平均体重与对照组和假手术组相比,有统计学差异(P<0.01)。给予吸氧处理后,高压氧组孕鼠体重较其他组增长快,孕16d时,高压氧组平均体重(303.38±9.23)g,高于模型组(291.75±13.56)g(P<0.05)、常压高浓度氧组(293.88±5.64)g(P>0.05)和常压低浓度氧组(290.75±11.91)g(P<0.05)。孕18d时,高压氧组平均体重(319.38±9.43)g,与对照组(328.75±10.94)g比无差异(P>0.05),且高于常压高浓度氧组(301.63±6.39)g和常压低浓度氧组(296.75±11.63)g(P<0.05),常压高浓度氧组孕鼠体重在吸氧后期增长加快,常压低浓度氧组仍无明显增长。孕21d时,模型组和常压低浓度氧组孕鼠平均体重无差异(P>0.05),分别为(311.25±12.17)g和(314.38±12.08)g,低于其他四组(P<0.01),高压氧组和常压高浓度氧组平均体重为(349.38±4.96)g和(346.25±6.94)g,两组无差异(P>0.05),与对照组(348.75±6.41)g比也无差异(P>0.05)。
　　 (2)孕12d时六组孕鼠全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数(AI)、血红细胞数、血红蛋白数及红细胞比积水平接近,无显著差异(P>0.05)。孕21d时六组孕鼠全血高切粘度、中切粘度、血红细胞数、血红蛋白数水平接近,无统计学差异(P>0.05)；单纯造模组孕鼠的血流变及血粘度相关指标升高,高压氧疗组及常压高浓度氧疗组孕鼠相关指标降低,与对照组和假手术组相似；单纯造模组和常压低浓度氧疗组全血低切粘度(20.81±5.17)mPa.S、血浆粘度(1.44±0.38)mPa.S、红细胞聚集指数(5.69±1.13)、红细胞比积(34.31±3.13)％均较前增加,高于其它4组(P<0.05)。高压氧疗组全血低切粘度(15.57±6.26)mPa.S、血浆粘度(1.06±0.30)mPa.S、红细胞聚集指数(4.60±1.01)、红细胞比积(30.23±3.05)％均较前降低,并低于单纯造模组和常压低浓度氧组(P<0.05),与对照组和假手术组相似,无统计学差异(P>0.05)。常压高浓度氧疗组全血低切粘度(17.01±4.17)mPa.S、血浆粘度(1.12±0.14)mPa.S、红细胞聚集指数(4.90±0.31)、红细胞比积(29.86±3.78)％也降低,但和单纯造模组相比只有血浆粘度和红细胞比积有统计学差异(P<0.05),和常压低浓度氧组相比则只有红细胞比积有统计学差异(P<0.05)。
　　 3.氧疗对各组胎鼠体重及胎盘重量的影响对照组胎鼠平均出生体重和胎盘重量分别为(4.57±0.37)g和(0.54±0.07)g,假手术组胎鼠平均出生体重和胎盘重量分别为(4.46±0.36)g和(0.53±0.08)g,两组无统计学差异(P>0.05),但重于单纯造模组和常压低浓度氧疗组(P<0.01)。单纯造模组胎鼠出生体重为(3.26±0.49)g,胎盘重量为(0.40±0.05)g,低于其他五组,有统计学差异(P<0.01)。给予吸氧处理后,高压氧疗组胎鼠出生体重和胎盘重量为(4.11±0.37)g和(0.47±0.05)g,常压高浓度氧疗组胎鼠出生体重和胎盘重量为(4.08±0.32)g和(0.46±0.05)g,高压氧疗组胎鼠出生体重和胎盘重量略高于常压高浓度氧疗组,但无统计学差异(P>0.05)；两组指标均高于单纯造模组和常压低浓度氧疗组(P<0.01),稍低于对照组和假手术组(P<0.01),常压低浓度氧疗组胎鼠出生体重和胎盘重量为(3.37±0.39)g和(0.41±0.05)g,稍高于单纯造模组,但无统计学差异(P>0.05),而低于另四组(P<0.01)。
　　 4.氧疗对胎鼠FGR发生率和死亡率的影响六组胎鼠的FGR率差异有统计学意义(P<0.001),单纯造模组胎鼠FGR发生率(83.1％)最高,其次为常压低浓度氧疗组(75.71％),对照组胎鼠FGR发生率最低(1.33％),与假手术组(2.94％)相似。给予吸氧处理后高压氧疗组和常压高浓度氧疗组FGR发生率分别为13.63％和13.89％,两组无差异(P>0.05),低于单纯造模组和常压低浓度氧疗组,高于对照组和假手术组。六组胎鼠死亡率有统计学差异(P=0.038),对照组和假手术组胎鼠死亡率分别为1.33％和1.47％,单纯造模组和常压低浓度氧疗组胎鼠死亡率高于其他四组,分别为11.27％和11.43％,高压氧疗组和常压高浓度氧疗组胎鼠死亡率低于单纯造模组,分别为6.06％和6.94％。
　　 5.氧疗对各组孕鼠胎盘结构和形态学的影响大体观察发现单纯造模组孕鼠子宫、胎盘明显呈瘀血、水肿状,胎盘颜色暗红,中央部分较对照组薄,胎盘母体面四周有白色渗出物覆盖,接近胎盘边缘白色钙化点呈灶性分布,呈程度不等的苍白带,胎儿面胎膜黄染,混浊,光泽较暗,胎盘整体呈慢性缺血缺氧改变。
　　 光镜观察各组胎盘的组织学变化:单纯造模组大鼠胎盘呈现瘀血状态,绒毛干有血液聚集、淤滞,绒毛结构模糊、萎缩,部分绒毛纤维素化,以致绒毛分支不良,绒毛面积减少,绒毛间隙加宽,营养交换面积减少,底蜕膜片状坏死；胎儿血管未扩张到合体细胞层,母胎屏障增厚,胎儿血液循环受阻,营养物质交换受阻。而高压氧疗组和常压高浓度氧疗组胎盘的血液微循环得到明显改善,绒毛面积增加,间隙减少,绒毛纤维素化及底蜕膜片状坏死明显减少,游离绒毛结构清晰,中轴内毛细血管未见充血,管壁较完整；底蜕膜层结构清晰,血管数目较多。
　　 胎盘绒毛表面积百分比:对照组为(58.98±1.16)％,与假手术组(58.67±0.28)％无差异,单纯造模组为(42.49±1.36％),小于对照组(P<0.05)；高压氧疗组和常压高浓度氧疗组分别为(57.95±1.22)％和(58.22±1.02)％,两组相比无差异(P>0.05)；常压低浓度氧疗组为(43.21±1.34)％,与单纯造模组相似(P>0.05),小于其他各组(P<0.05)。
　　 结论
　　 1.本研究发现大鼠结扎子宫部分血管的孕期时间越提前,胎鼠出生体重和胎盘重量越低,胎鼠FGR发生率和死亡率越高。造模A组大鼠在孕12d结扎部分子宫血管后,胎鼠出生体重和胎盘重量均低于另2组(孕14d和孕16d),FGR发生率高达84.13％,但除少数胚胎(11.11％)因发育不良或慢性缺血缺氧导致死亡吸收外,其余胎鼠在足月分娩当天均尚能存活,且胎鼠的畸形率发生极少,因此认为孕12d部分结扎孕鼠子宫血管能达到理想的FGR造模效果,可用于后期的实验研究。
　　 2.高压氧疗组和常压高浓度氧疗组的FGR孕鼠,经过氧疗后,其胎鼠的出生体重及胎盘重量均高于单纯造模组,胎鼠FGR的发生率及死亡率亦大大低于单纯造模组,只略高于对照组,说明两组的治疗对母体胎儿因素导致的FGR胎鼠均有作用。常压低浓度氧疗组的FGR孕鼠体重增长缓慢,胎鼠出生体重及胎盘重量低于对照组,胎鼠的FGR发生率和死亡率高于对照组,与单纯造模组类似,提示常压低浓度氧疗对FGR胎鼠的治疗作用不大。由于高压氧疗压力高于常压容易发生氧中毒,加压、减压可能对孕妇或胎儿造成不良反应如流产、早产[6,7]等,因此孕期高压氧疗在临床并未广泛应用,本实验为今后将常压高浓度氧疗用于治疗FGR的临床实验奠定了基础,但其对子代存在的近期或远期影响,尚待进一步研究。
　　 3.单纯造模组孕鼠血液粘度相关指标高于对照组孕鼠,高压氧疗组和常压高浓度氧疗组均在不同程度上降低了FGR孕鼠的血液血浆粘度、红细胞聚集指数和红细胞比积,说明氧疗可能是通过降低孕鼠血液粘度而改善了胎盘缺血缺氧状况,从而达到治疗FGR的目的。
　　 4.单纯造模组胎盘整体呈慢性缺血缺氧改变,光镜下呈现瘀血状态,纤维素样坏死多见,绒毛面积减少,而高压氧疗和常压高浓度氧疗能够促进FGR大鼠胎盘的修复,改善胎盘缺血缺氧微循环,从而达到治疗FGR的目的,其具体分子机制尚有待进一步研究。