宫内生长受限抑制胎儿脑功能发育及孕鼠补充牛磺酸促进生长受限胎鼠神经元增殖研究

摘要

研究目的：
　　1、宫内生长受限(intrauterine growth restriction,IUGR)是临床常见并发症,而且大多数IUGR胎儿出生后即为小于胎龄儿(small for gestational age,SGA)。近年来,IUGR对胎儿脑发育的不良影响受到高度关注,明显增加儿童神经发育障碍和不良神经心理的发生风险,导致学习和记忆功能障碍,以及成年期较低的学术成就和较差的专业表现等不良预后。但 IUGR是否影响胎儿脑功能的发育尚不明确。在本项研究中,通过应用振幅整合脑电图(amplitude integrated electroencephalography,aEEG),监测生后3d内足月SGA脑功能的变化,并与同期出生的足月适于胎龄儿(appropriate for gestational age,AGA)对比,以了解IUGR是否会对胎儿脑功能发育造成不良影响。
　　2、IUGR所致脑损伤始于宫内,故出生后所采取措施难以从根本上改善IUGR患儿的神经系统不良预后,而积极产前干预是改善 IUGR预后的根本途径。牛磺酸是胎儿-新生儿中枢神经系统发育的必需氨基酸,而蛋白激酶A-(protein kinase A)-钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase III)/c-fos(PKA-CaMKⅡ/c-fos)信号通路是调节中枢神经系统发育的重要途径之一,故本研究在国家自然科学基金(81170577)的资助下,拟通过建立IUGR模型(SD大鼠),采用实时定量聚合酶链反应(real time-Polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(western-blot,WB)及免疫组化的方法,检测孕鼠IUGR胎鼠脑组织中牛磺酸对PKA、CaMK II、c-fos关键信号分子和脑组织神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达的影响,以探讨孕鼠补充牛磺酸是否可通过调节该信号通路的活性而促进IUGR胎鼠脑细胞增殖,为产前补充牛磺酸促进IUGR胎儿脑发育提供新的理论依据。
　　研究方法：
　　1、临床研究:选择2012年08月01日至2013年02月28日在北京军区总医院附属八一儿童医院新生儿科住院、胎龄37～40+6周的足月小于胎龄儿(SGA)60例和适于胎龄儿(AGA)40例。2组患儿均无出生时无窒息史,并除外惊厥、颅内出血、脑室周围白质软化、颅内感染、胆红素脑病及先天性畸形等疾病。使用 CFM6000型振幅整合脑电图(amplitude-integrated electroencephalography,aEEG)仪于生后3d内进行监测记录。比较2组婴儿脑电波形的连续性、睡眠-觉醒周期(sleep wake cycling,SWC)、爆发间期(interburst interval,IBI)、最低和最高电压等指标的差异。所有资料在Excel上建立数据文件,使用SPSS16.0软件进行统计学处理,P<0.05认为有统计学意义。
　　2、实验研究:采用全程低蛋白饮食法建立IUGR模型,将雌性大鼠随机分为对照组、IUGR组及IUGR+孕鼠补充牛磺酸组(牛磺酸组),每组5只。
　　采用RT-PCR监测各组胎鼠脑组织PKA、CaMKⅡ、c-fos-mRNA的表达水平,WB方法检测各组胎鼠脑组织PKA、CaMK II、c-fos蛋白表达,免疫组织化学方法检测各组胎鼠脑组织PKA、CaMK II、c-fos、NSE阳性细胞数。
　　研究结果：
　　1、临床研究结果:
　　⑴SGA连续性脑电图的出现率、睡眠-觉醒周期出现率低于适于胎龄儿,爆发间期长于适于胎龄儿,最高电压与最低电压均低于适于胎龄儿,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　⑵对出生体重低于同胎龄第5~10百分位、第3～5百分位和低于第3百分位者的aEEG指标分别进行了比较,结果表明不同出生体重百分位小于胎龄儿连续性脑电图的出现率、睡眠-觉醒周期的出现率、爆发间期以及最低和最高电压差异无统计学意义(P>0.05)。
　　⑶对不同胎龄 SGA各指标分别比较,除最低电压外,其它指标均无差异(P>0.05)。对不同胎龄AGA各指标分别比较,均无差异(P>0.05)。
　　⑷不同胎龄时,~37+6W组患儿,其 SGA组与 AGA组最低电压无明显差别(P>0.05),其他各胎龄组(~38+6W、~39+6W、~40+6W)患儿,其SGA组连续性脑电图的出现率、睡眠-觉醒周期出现率低于AGA组,爆发间期长于AGA组,最高电压与最低电压均低于AGA组,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　⑸对单纯低血糖组(血糖<2.2μmol/L、但未发生低血糖脑病)与正常血糖组各项指标进行比较,发现aEEG连续性、周期性、爆发间期、最高电压与最高电压等指标之间差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　⑹对单纯高胆红素血症(血胆红素值>220μmol/L、但未发生胆红素脑病)与正常血胆红素组各项指标进行比较,发现aEEG连续性、周期性、爆发间期、最高电压与最高电压等指标之间差异均无统计学意义(P>0.05)。
　　2、实验研究结果:
　　⑴RT-PCR:IUGR组胎鼠脑组织PKA、CaMK II、c-fos-mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),而牛磺酸组各指标-mRNA表达均显著增高(P<0.05)。
　　⑵WB:IUGR组胎鼠脑组织中PKA、CaMK II、c-fos蛋白表达水平均显著下降(P<0.05),而孕鼠补充牛磺酸可显著增加其脑组织中 PKA、CaMK II、c-fos蛋白表达水平(P<0.05)。
　　⑶免疫组化:
　　PKA阳性表达主要位于胞浆,呈棕黄色。IUGR胎鼠大脑海马内仅有少量PKA阳性细胞分布,牛磺酸组PKA阳性细胞数量明显增多(P<0.05)。
　　CaMK II阳性表达也主要位于细胞质,呈棕黄色,IUGR胎鼠大脑海马内仅有少量 CaMK II阳性细胞分布,而牛磺酸组 CaMKⅡ阳性细胞数目明显增加(P<0.05)。
　　c-fos阳性表达主要位于细胞核,呈棕黄色,只有少数的c-fos阳性细胞在IUGR胎鼠大脑海马中分布,而孕鼠补充牛磺酸后c-fos阳性细胞数量较模型组明显增多(P<0.05)。
　　NSE阳性表达主要位于细胞质,呈棕黄色,IUGR组胎鼠脑组织NSE阳性细胞数较对照组明显减少(P<0.05),而牛磺酸组胎鼠脑组织中 NSE阳性细胞数较IUGR组明显增多(P<0.05)。
　　结论：
　　1、IUGR可抑制胎儿脑功能发育:表现为患儿脑电波连续性差、缺乏睡眠-觉醒周期、爆发间期延长、最高电压与最低电压均较低等。
　　2、孕鼠补充牛磺酸可上调 IUGR胎鼠脑组织 PKA、CaMK II、c-fos-mRNA及蛋白表达水平,并增加PKA、CaMK II、c-fos、NSE阳性细胞数,提示牛磺酸可能通过促进PKA-CaMKⅡ/c-fos信号通路活性的而促进IUGR胎鼠神经元增殖。
　　3、本研究为产前补充牛磺酸促进IUGR胎儿脑发育提供了进一步的理论支持。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 临床研究宫内生长受限抑制胎儿脑功能发育的研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 实验研究孕鼠补充牛磺酸上调PKA-CaMKⅡ/c-fos信号通路活性促进生长受限胎鼠神经元增殖的研究

1前言

2 材料与方法

3结果

4讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

综述