高糖诱导INS-1细胞损伤的记忆效应研究

摘要

背景：众多的临床试验均显示高血糖介导的糖尿病相关并发症在血糖控制正常后仍持续进展,即所谓高血糖的“代谢记忆”。“代谢记忆”的概念是在DCCT(糖尿病控制与并发症试验)研究后续的EDIC(糖尿病干预和并发症的流行病学研究)研究结果公布后被提出的。在EDIC研究中,长期随访结果表明:先前传统治疗组的视网膜病变、白蛋白尿、高血压、神经病变和心血管事件的发生率均高于强化治疗组,而两组的HbAlc水平并没有明显差异。随着UKPDS研究10年随访结果的公布,血糖“的代谢记忆”在糖尿病患者中的存在得到了进一步的证实。因此,糖尿病患者中存在着高糖的“代谢记忆”。
　　 Kern实验室首次在糖尿病狗视网膜病变研究中报道了这种记忆效应。结果显示:高糖后2个月即获严格控制的狗未出现视网膜病变,而2.5年后开始严格控制血糖的狗,其视网膜病变发生率则与整个5年中血糖控制不良的对照狗相似。Lorenzi实验室发现,链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠在历经数周高血糖后,肾脏基底膜出现纤连蛋白mRNA的高表达,而在纠正高糖后,其基底膜纤连蛋白mRNA仍持续高表达。随后他们发现,人脐静脉内皮细胞在经历数周高血糖后,也会出现类似的记忆效应,表现为纠正高糖后,粘连蛋白mRNA及Ⅳ型胶原mRNA的持续高表达。
　　 2007年,Ihnat等在人脐静脉内皮细胞及视网膜色素上皮细胞上进行了有关记忆效应及其机制的相关研究。研究采用高糖环境中培养14天后在正常葡萄糖水平下培养7天的实验模式,观察了活性氧在内的大量氧化应激指标。结果发现,接受高糖刺激14天的细胞,在纠正高糖后,其高糖造成的损伤仍持续存在,主要表现为活性氧、蛋白激酶-C、凋亡蛋白等损伤指标的持续升高。课题组进一步对其机制进行了探索,首次发现使用抗氧化剂清除自由基可以清除其细胞产生的记忆效应,提示记忆效应的产生与高糖刺激后产生的大量活性氧存在着密切的关系。在08年的The Journal of Experimental Medicine上有研究报道,牛及人的主动脉内皮细胞在接受16 h高血糖(30mmol/L)刺激后,可引起NF-κB亚基p65基因的表达增加,而在血糖恢复正常后,p65基因表达的升高至少还可持续6天。实验组进一步研究发现,抗氧化应激干预可以纠正高糖后炎性因子的持续高表达,提示氧化应激在高糖诱导产生的记忆效应中可能起了重要的作用,这与Ihnat等的发现相符。由此可见,记忆效应在细胞中也是存在的,而氧化应激可能是其产生的重要机制。
　　 胰岛β细胞凋亡与功能障碍是糖尿病发生、发展的关键环节,加强对其相关机制的研究具有重要意义。既往研究提示,慢性高血糖可以造成胰岛β细胞凋亡,而导致胰岛功能的进行性衰竭,即所谓的“葡萄糖毒性”。进一步的研究提示,氧化应激是造成胰岛β细胞“葡萄糖毒性”的重要机制之一。氧化应激是指由于活性氧簇(ROS)产生速率超过其被清除的速率,引起ROS的过度蓄积,最终造成细胞损伤和功能障碍的现象。体内的各种组织细胞中,胰岛β细胞内超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶含量较其他组织细胞低,且胰岛β细胞DNA对于氧化损伤的修复能力差,故对氧化应激极为敏感,易受到活性氧的损伤。
　　 综上所述,高糖刺激可导致内皮细胞炎性基因的持续表达,凋亡蛋白的持续增高,线粒体DNA的持续损伤等多种记忆效应的形成,此记忆效应形成的关键可能是ROS的过度生成。胰岛β细胞由于抗氧化酶的含量及活性均较低,故易受氧化应激损伤。那么高糖诱导胰岛细胞自身的氧化应激损伤是否也会诱导胰岛细胞产生记忆效应,造成胰岛细胞持续的损伤呢?目前未见相关文献报道。胰岛β细胞损伤是糖尿病发生、发展的重要机制,高糖诱导胰岛细胞的凋亡是胰岛细胞功能衰竭的重要因为,而细胞的凋亡又受到相关基因的调控。因此,本研究以INS—1细胞为研究对象,以bax,bc1-2,caspase-3这些调控凋亡的基因以及反映细胞数量的细胞活力来作为评估胰岛细胞损伤的指标,观察胰岛细胞对高糖造成的损伤是否存在记忆效应,并初步探讨其产生的可能机制。
　　 研究分为以下两个部分进行:
　　 第一章、高糖诱导INS-1细胞损伤的记忆效应的现象观察
　　 目的：观察高糖刺激及纠正高糖后INS-1细胞是否存在持续性损伤。
　　 对象和方法：
　　 1、以大鼠胰岛β细胞瘤株INS—1细胞为研究对象,采用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养,置于37℃、5％CO2的培养箱内。
　　 2、实验分为4组:
　　 (1)对照组(细胞培养于葡萄糖浓度为11.1mmol/LRPMI1640完全培养基中培养7天)。
　　 (2)高糖组(细胞培养于葡萄糖浓度为33.3mmol/LRPMI1640完全培养基中培养2天)；
　　 (3)3天记忆组(33.3mmol/L葡萄糖培养2天后转为11.1mmol/L葡萄糖培养3天)；
　　 (4)5天记忆组(33.3mmol/L葡萄糖培养2天后转为11.1mmol/L葡萄糖培养5天)。
　　 3、四氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞活力:各组细胞干预结束后,分别经MTT、二甲亚砜处理后,酶标仪检测各孔490nm处的光吸收值(OD值)。结果以正常对照组OD值标化余各组OD值,即设定正常对照组细胞活力为100％,由此计算余各组细胞活力百分比。
　　 4、RT-PCR检测各组的细胞的mRNA水平:用Trizol试剂提取各组总RNA。提取的RNA测定其浓度与纯度,经测定样本纯度为符合条件2>A260/280>1.8后,采用两步法逆转录反应生成cDNA。ABI-7500定量PCR仪利用染料法进行PCR反应后,分别观察溶解曲线,扩增曲线,并对不同组内的目的基因产物和管家基因产物进行数据分析,得出基因表达的相对定量(由RQ值表示),以此反映其mRNA水平的变化。
　　 5、统计学处理:采用SPSS13.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准差((x)±s)表示,若方差齐性,各组均数比较采用单向方差分析(One-wayANOVA),若方差不齐,采用Welch法近似方差分析；组内多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。P≤0.05被认为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、各组细胞OD值检测:对照组、高糖组、3天记忆组、5天记忆组OD值分别是1.132±0.161,0.578±0.094,0.656±0.077,0.632±0.067。根据公式计算各组细胞活力后,对各组细胞活力进行统计分析。对照组、高糖组、3天记忆组、5天记忆组细胞活力分别是:1.000±0.000,0.520±0.122,0.583±0.048,0.597±0.075。与对照组比较,高糖组细胞活力显著下降(P=0.016)。3天记忆组、5天记忆组细胞活力也较对照组显著下降(P=0.002,P=0.006)。
　　 2、各组mRNA表达水平比较:
　　 对照组、高糖组、3天记忆组、5天记忆组bax RQ值(基因表达的相对定量)分别是1.000±0.000,1.886±0.101,2.968±0.198,3.173±0.221；caspase-3的RQ值分别是1.000±0.000,1.692±0.212,2.468±0.499,2.253±0.563；bcl-2的RQ值分别是1.000±0.000,0.474±0.131,0.546±0.155,0.562±0.086。与对照组比较,高糖刺激INS-1细胞2天后,bax,caspase-3 mRNA水平显著增加(P=0.002,P=0.002)。在纠正高糖后的第3天,第5天,bax mRNA水平较对照组仍显著增高(P值均为0.001)。在纠正高糖后的第3天,第5天,caspase-3 mRNA水平较对照组也仍显著增高(P=0.004,P=0.013)。高糖刺激INS-1细胞2天后,bcl-2 mRNA水平显著降低(P=0.015),在纠正高糖后的第3天,第5天,bcl-2的mRNA水平较对照组仍显著降低(P=0.036,P=0.008)。
　　 结论：
　　 1、高糖可以通过调控凋亡相关基因,诱导INS-1细胞的凋亡,导致其细胞数量减少,功能受损。
　　 2、INS-1细胞对高糖的损伤存在记忆效应,在纠正高糖后,其细胞仍持续损伤,主要表现为细胞活力的持续降低,促凋亡基因的持续高表达,抑凋亡基因的持续低表达。
　　 第二章、高糖诱导INS-1细胞损伤的记忆效应机制初探
　　 目的：初步探讨高糖诱导INS-1细胞产生记忆效应的机制。
　　 对象和方法：
　　 1.研究对象为大鼠胰岛β细胞瘤株INS-1细胞。
　　 2、实验分为4组:
　　 (1)对照组(细胞培养于葡萄糖浓度为11.1mmol/LRPMI1640完全培养基中培养7天)；
　　 (2)高糖组(细胞培养于葡萄糖浓度为33.3mmol/LRPMI1640完全培养基中培养2天)；
　　 (3)记忆组(33.3mmol/L葡萄糖培养2天后转为11.1mmol/L葡萄糖培养5天)；
　　 (4)干预组(33.3mmol/L葡萄糖培养2天后,转为11.1mmol/L葡萄糖+终浓度为62.5umol/L的α-硫辛酸共同培养5天)。
　　 3、抗氧化应激干预:选用的抗氧化剂为Lipoic acid(α-硫辛酸),为黄色粉末,分子量为206.33,根据分子量配制成终浓度大于62.5umol/L的母液,分装后-20℃保存备用。实验正式进行时,取母液配成终浓度为62.5umol/L的工作液,加入干预组培养基中。
　　 4、细胞ROS产量的检测:以DHE为荧光探针,在300nm激发波长,610nm发射波长的设置下,酶标仪检测各组细胞ROS平均荧光强度(mean fluorescenceintensity,MFI)。实验中设立不添加探针的阴性对照组。
　　 5、四氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞活力:各组细胞干预结束后,分别经MTT、二甲亚砜处理后,酶标仪检测各孔490nm处的光吸收值(OD值)。结果以正常对照组OD值标化余各组OD值,即设定正常对照组细胞活力为100％,由此计算余各组细胞活力百分比。
　　 6、RT-PCR检测各组的细胞的mRNA水平:用Trizol试剂提取各组总RNA。提取的RNA测定其浓度与纯度,经测定样本纯度为符合条件后,采用两步法逆转录反应生成cDNA。ABI-7500定量PCR仪利用染料法进行PCR反应后,分别观察溶解曲线,扩增曲线,并对不同组内的目的基因产物和管家基因产物进行数据分析,得出基因表达的相对定量(由RQ值表示),以此反映其mRNA水平的变化。
　　 7、统计学处理:采用SPSS13.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准差((x)±s)表示,若方差齐性,各组均数比较采用单向方差分析(One-wayANOVA),若方差不齐,采用Welch法近似方差分析；组内多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett's T3法。P≤0.05被认为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、各组mRNA表达水平比较:
　　 (1)对照组、高糖组、记忆组、干预组的bax RQ值分别是1.000±0.000,2.241±0.310,3.016±0.240,1.427±0.189。与对照组比较,高糖组及记忆组的bax mRNA表达水平显著升高(P<0.001)。与记忆组比较,干预组的bax mRNA表达水平显著降低(P<0.001)。
　　 (2)对照组、高糖组、记忆组、干预组的caspase-3的RQ值分别是1.000±0.000,1.774±0.119,2.403±0.427,1.218±0.177。与对照组比较,高糖组及记忆组的caspase-3 mRNA表达水平显著升高,差异均具有统计学意义(P=0.004,P=0.027)。与记忆组比较,干预组的caspase-3 mRNA表达水平显著降低(P=0.029)。
　　 (3)对照组、高糖组、记忆组、干预组的bcl-2的RQ值分别是1.000±0.000,0.496±0.094,0.559±0.130,0.903±0.093。与对照组相比,高糖组,记忆组bcl-2mRNA水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.001,P=0.002),干预组bcl-2 mRNA水平较记忆组显著上升(P=0.003)。
　　 2、各组细胞ROS产量:对照组、高糖组、记忆组、干预组ROS产量分别是0.549±0.170、1.086±0.120、0.992±0.113、0.699±0.114。与对照组相比,高糖组,记忆组ROS水平显著升高(P＜0.001)。干预组的ROS水平较记忆组显著下降(P=0.001)。
　　 3、各组细胞活力检测:对照组、高糖组、记忆组、干预组OD值分别是1.126±0.166、0.554±0.088、0.592±0.084、1.083±0.181。根据公式计算各组细胞活力后,对各组细胞活力进行统计分析,对照组、高糖组、记忆组、干预组细胞活力分别是:1.000±0.000、0.500±0.101、0.553±0.093、0.977±0.210。与对照组相比,高糖组、记忆组细胞活力均显著下降(P<0.001)。干预组与记忆组比较,细胞活力显著升高(P=0.014)。
　　 结论：
　　 1、ROS水平的持续升高与高糖诱导INS-1细胞损伤的记忆效应产生有密切关系,氧化应激可能是高糖诱导INS-1细胞损伤的记忆效应形成的重要机制。
　　 2、抗氧化干预可以在一定程度上减少高糖诱导的INS-1细胞的持续性损伤。