维胃方对胃溃疡大鼠胃粘膜MPO-H+-K+-ATP酶活性影响的研究

摘要

课题依据:
　　 胃溃疡病(GU)是一种多病因疾病,亦是消化系统的常见疾病,呈世界性分布,约有5％-10％的人一生中患过此病。其发病机制较为复杂,目前认为各种与发病有关的因素,如胃酸、胃蛋白酶、感染、遗传、体质、环境、饮食、生活习惯、神经精神因素等,通过不同的途径或机制,使胃粘膜攻击因子和自身防御一修复因子之间失衡所致,其临床特点为病程长,易复发,且常伴一些严重的并发症。
　　 目前治疗消化性溃疡的药物主要为质子泵抑制剂(PPI)和H2受体拮抗剂(H2R),因这两种药物的使用,使胃溃疡的愈合率显著提高,但由于患者依从性、耐药性、费用、副作用等问题的持续存在,致使该病的复发率仍居高不下。因此,研究胃溃疡的理想治疗方案仍是一项急迫而重要的任务,近几年来人们对于胃溃疡治疗药物的开发,往往从天然药物上寻找突破口。
　　 中医对该病有着悠久的理论研究历史,积累了大量的临床诊治经验,尤其是金元时期以李东垣《脾胃论》为标志而形成雏形的脾胃学说。导师勤求古训、博采众方,创制出了治疗胃溃疡的经验方——维胃方,其由茯苓、蒲公英、白及、三七组成,全方配伍攻补兼施、标本兼治,通过临床实践证明其对溃疡愈合及抗复发均有较为满意的效果。本课题以中医理论为指导,以MPO、H+K+-ATP酶为切入点,参照Watanebet等的经典造模方法并加以改进,建立乙酸诱导大鼠胃溃疡模型,该模型的特点在于,其肉眼观察和组织形态学观察均与人类的消化性溃疡非常相似,持续时间短则8-10天,长则半年,一般60天左右可以自然愈合,自然复发率约为30％,并通过观察胃大体标本,进一步对造模处病理切片进行镜下病理观察,测定胃粘膜MPO、H+-K+-ATP酶活性,从而观察并探讨维胃方对大鼠实验性胃溃疡的治疗机制。
　　 实验方法:
　　 SPF级Wistar雄性大鼠56只,180～220g/只,随机分为如下7组:正常组、模型组、自愈组、维胃方高剂量组、维胃方中剂量组、维胃方低剂量组、雷尼替丁组。正常组每日予正常饮食,模型组在造模3d后处死,自愈组观察胃溃疡自愈情况,与用药组同时处死。其余各用药组均在造模3d后予相应药物2ml/d灌胃,给药7d后处死。除正常组外,余各组大鼠造模前禁食不禁水24h,予10％水合氯醛腹腔内注射麻醉后,于剑突下纵向逐层切开腹壁约2em,拉出胃体,并在胃前壁窦体交界处靠胃窦侧浆膜面,用浸泡过100％乙酸的直径5mm滤纸片压贴60s,然后将胃体送回体内,逐层缝合腹壁,最后用75％酒精消毒手术切口。采集标本前大鼠禁食不禁水24h,具体步骤如下:①称重,10％水合氯醛腹腔内注射麻醉后备皮,固定；②取出鼠胃,置于冰面上,沿胃大弯剪开鼠胃,展平,冲洗胃内壁,观察胃粘膜大体标本；③取部分溃疡处腺胃组织放入10％甲醛溶液中固定12～16h(4℃),进一步石蜡包埋,制作病理切片；④在冰面上用玻片将新鲜腺胃部胃粘膜组织及粘液轻轻刮下,-80℃低温冷冻后用万分之一天平准确称重,与冰生理盐水按1:9的比例按常法制备成10％组织匀浆,10000r/min低温离心10min,取上清液储于-20℃冰箱中备用,分别用于测定总蛋白、MPO、H+-K+-ATP酶活性。
　　 统计学处理:
　　 实验数据用均数±标准差((x)±s)表示。多样本均数比较用单因素方差(One-Way ANOVA)分析,组间均数两两比较,若方差齐性,用LSD法,若方差不齐,则用Dunnett's T3法,检验水准为α=0.05。所有数据均用SPSS13.0软件进行统计。
　　 主要结果:
　　 1、胃粘膜大体标本观察正常组大鼠胃粘膜光整完好,无充血、水肿、糜烂等；模型组大鼠浆膜层充血水肿,表面可见少量淡咖啡色物质,胃粘膜充血、水肿、糜烂,多处可见出血点和溃疡；自愈组大鼠浆膜层充血、水肿、粘连,胃粘膜表面充血、糜烂,溃疡愈合不全；维胃方中剂量组大鼠胃粘膜表面光滑,轻度淤血；维胃方高、低剂量组大鼠胃粘膜存在出血点或较小溃疡,淤血较为明显；雷尼替丁组大鼠胃粘膜表面轻度淤血,未见溃疡,偶见充血或糜烂点。
　　 2、病理切片镜下观察正常组大鼠胃粘膜层光整完好,腺体排列整齐,未见炎细胞浸润及粘膜下出血倾向；模型组粘膜层变薄,部分溃疡深及肌层,粘膜下层毛细血管内可见明显的血流瘀滞,大量炎性细胞浸润,平滑肌细胞排列紊乱或出现断裂；自愈组大鼠胃粘膜缺损达腺细胞层或粘膜下层,腺细胞排列紊乱,粘膜下层毛细血管内可见明显血流瘀滞,有炎细胞浸润,肌细胞部分断裂；维胃方中剂量组大鼠胃粘膜偶见断裂,上皮细胞肿胀,腺体间隙扩大,但粘膜下层微循环无明显病理改变；维胃方高、低剂量组部分溃疡缺损达粘膜下层,腺细胞密度不匀,粘膜下层炎细胞浸润；雷尼替丁组偶见缺损达腺细胞层,腺体结构良好,肌层细胞排列紊乱,未见明显溃疡病变。
　　 3、MPO活性变化方差齐,F=77.085,P=0.000,差异有显著性意义,可认为各组胃粘膜MPO活性存在差别,造模后模型组大鼠胃粘膜MPO活性与正常组相比显著升高(P=0.000),自愈组与模型组相比无显著差异(P=0.409)。经维胃方及雷尼替丁治疗的组别,胃粘膜MPO活性均较自愈组显著降低(维胃方高中低剂量各组、雷尼替丁组与自愈组相比,P值分别为:0.000、0.000、0.048、0.001),其中以维胃方中剂量组降低最为显著(平均值为:1.739±0.268),但维胃方高、中剂量不呈剂量依赖关系,中剂量组反而低于高剂量组。雷尼替丁组与维胃方高、低剂量组比较无显著性差异(P值分别为0.111、0.125),与中剂量组比较则有显著性差异(P=0.000),且高于中剂量组。
　　 4、H+-K+-ATP酶活性变化方差齐,F=22.891,P=0.000,差异有显著性意义,可认为各组胃粘膜H+-K+-ATP酶活性存在差别,模型组的H+-K+-ATP酶活性显著低于正常组及自愈组(P值分别为0.000、0.000),而经药物治疗后,各治疗组H+-K+-ATP酶活性均接近正常组(维胃方高中低剂量各组、雷尼替丁组与正常组相比,P值分别为:0.081、0.053、0.316、0.136),且高于自愈组(维胃方高中低剂量各组、雷尼替丁组与自愈组相比,P值分别为:0.025、0.040、0.000、0.013)。
　　 结论:
　　 1、动物实验是研究疾病发生机理和寻找药物作用机制的重要手段,乙酸造模法是直接以乙酸烧灼胃浆膜面形成溃疡,其表现和溃疡愈合速度与人类消化性溃疡极为相似,适合用于药物疗效的观察研究,且造模稳定性高,方法简单,可操作性强,是目前普遍认可与使用的方法。
　　 2、根据胃大体标本的观察情况,造模成功率高达100％,自愈组大鼠胃溃疡的自愈效果差,用药组起到一定治疗作用,并以维胃方中剂量组的疗效为最佳。用药各组溃疡愈合情况与自愈组相比有明显区别,尤其是维胃方中剂量组及雷尼替丁组,愈合效果均优于其他组别。
　　 3、从镜下病理切片观察情况来看,维胃方中剂量组更接近正常组,腺体形态基本完好,炎性细胞少,粘膜下微循环未见明显病理状态,恢复情况较好,证明其治疗胃溃疡的部分机制是通过改善微循环、抗炎和细胞再生。模型组胃粘膜破坏较严重,缺损偶及肌层,造模处腺体完全破坏,非造模处炎性细胞浸润严重,腺体变形,粘膜下微循环病理改变明显。
　　 4、在对维胃方各组的治疗效果观察中,其表现出了复杂的量效关系,说明在药材、煎煮等均相同的条件下,中药的剂量对疗效影响极为重要。
　　 5、对大鼠胃粘膜MPO活性的测定结果反映出:维胃方对胃溃疡的治疗效果是明显的,数据中各治疗组活性均较自愈组及模型组低(维胃方高中低剂量各组、雷尼替丁组与模型组比较,P值分别为:0.000、0.000、0.006、0.000,与自愈组比较,P值分别为:0.000、0.000、0.048、0.001),维胃方高、低剂量组活性与雷尼替丁组相比无统计学意义(P值分别为0.111、0.125),但中剂量组活性低于雷尼替丁组(P=0.000),表明其抗炎作用优于雷尼替丁。
　　 6、从H+-K+-ATP酶活性变化的数据统计结果可以看出:溃疡程度越严重,胃泌酸功能越差,其活性越低(模型组与正常组比较P=0.000),而经维胃方治疗后,各组的活性均接近正常组(维胃方高、中、低剂量组与正常组比较,P值分别为:0.081、0.053、0.316),与雷尼替丁组的值亦很接近,说明维胃方有明显修复胃粘膜溃疡的作用,其可能机理并非在于抑制基础胃酸分泌,相反,它能修复受损的胃粘膜,使其泌酸功能恢复正常,其效果与临床常用胃溃疡治疗药物雷尼替丁相似,这也符合大体标本的观察结果。
　　 综上所述,本研究的实验造模是成功的,通过对大鼠胃溃疡大体愈合情况及溃疡处粘膜病理组织切片光学显微镜下观察,发现维胃方能通过改善微循环、抗炎和细胞再生有效治疗胃溃疡,并以其临床标准剂量--中剂量组疗效最佳,其能修复胃的生理结构,从而达到抗炎和恢复胃泌酸功能,发挥整体治疗作用。