血清sTWEAK与冠心病严重程度及预后关系的研究

摘要

[研究背景]
　　 冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronaryheartdisease，CHD，冠心病）是指由于冠状动脉粥样硬化导致管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病。目前，冠心病在我国发病率、死亡率逐年升高，成为心血管病研究的热点。
　　 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发病机制是各种危险因素致动脉内皮的损伤，内皮细胞被激活，表达细胞间粘附分子(intercellularcelladhesionmolecules，ICAMs)和血管粘附分子(vascularcelladhesionmolecules，VCAMs),使循环中单核细胞和血小板粘附于受损内皮细胞。粘附的内皮细胞和单核细胞被激活释放IL-6、IL-8、IFN-γ等多种炎症因子和多种趋化因子，而血小板释放包含某些趋化因子和炎症因子的颗粒。这些因子使AS病灶区炎症细胞累积并持续分泌释放更多的炎症因子，加速粥样斑块进展。近年来发现的肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子(tumornecrosisfactor-likeweakinducerofapoptosis，TWEAK)参与粥样硬化的慢性炎症过程，研究表明它在动脉粥样硬化和冠心病的病理生理过程中发挥不可或缺的作用。
　　 TWEAK是肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)家族的成员之一，其基因定位于17号染色体p13.1，起初表达为膜结合TWEAK(membrane-boundTWEAK，mTWEAK)，继而被蛋白酶水解为可溶性TWEAK(solubleTWEAK，sTWEAK)，sTWEAK与mTWEAK具有类似的生物学活性。在动脉粥样硬化时，TWEAK可由内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞表达，通过与特异性受体Fn14结合，激活NF-κB、MAPK等信号通路，激活并诱导内皮细胞的ICAMs和VCAMs表达，使血管平滑肌细胞和内皮细胞增殖和迁移，诱导巨噬细胞分泌趋化因子和炎症因子，是维持粥样硬化慢性血管炎症的重要细胞因子。此外，TWEAK作用于巨噬细胞和血管平滑肌细胞表面的Fn14受体，从基因转录水平上调基质金属蛋白酶(matrixmetalprotonase，MMP)表达，后者能够分解粥样斑块内致密纤维帽中的胶原蛋白和纤维蛋白以及其它基质蛋白成分，使粥样斑块的纤维帽与脂质核心的结合趋于不稳定，这是导致粥样斑块破裂的重要原因之一，也是发生急性心肌梗死的潜在危险因素。当破损血管或血流缓慢的血管段出现血小板聚集并可释放的含有sTWEAK的颗粒，其sTWEAK可诱导病变段血管内皮粘附分子的表达，从而加速血小板的粘附过程，加速血管内血栓形成。
　　 目前研究发现，注射重组TWEAK的ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样斑块面积显著高于对照组;相反，用TWEAK抗体干预的ApoE基因敲除小鼠的主动脉粥样斑块面积显著减小。体外实验发现，给予TWEAK干预的血管平滑肌细胞和血管内皮细胞增殖显著高于对照组。临床研究发现，在腹主动脉瘤、慢性心功能不全等心血管疾病sTWEAK血清水平都有表达改变。目前sTWEAK与冠心病严重程度及预后关系的临床研究甚少，本研究观察sTWEAK在不同严重程度的冠心病患者中表达水平的差异、sTWEAK与急性心梗发生的关系以及对冠心病预后的影响，为冠心病的诊治提供新思路。
　　 [研究目的]
　　 本研究观察在不同冠心病临床分型及对照组中血清sTWEAK表达差异和多种临床指标与sTWEAK血清水平的相关性;评估sTWEAK与冠脉病变程度及冠心病患者发生心血管事件风险的关系。
　　 [对象和方法]
　　 1.研究对象
　　 1.1设计和分组
　　 1.1.1收集广州军区广州总医院心血管内科从2008年6月1日至2010年1月1日收入院的冠脉造影术确诊的CHD患者217例，按照CHD的临床分型分为急性心肌梗死组(AMI组)(n=78)、不稳定性心绞痛组(UAP组)(n=111)、稳定性心绞痛组（SAP组）(n=28)，同时选取同期收治的同年龄组冠脉造影术确诊的无冠心病的健康个体作为对照(n=30)，研究各组sTWEAK血清水平差异。
　　 1.1.2分别在CHD和AMI患者中研究临床指标对sTWEAK表达影响，研究sTWEAK与Gensini评分的关系。CHD患者中研究sTWEAK及多种可能的危险因素与急性心肌梗死的关系。
　　 1.1.3以ROC曲线cutoff值为切点将冠心病患者分为sTWEAK高水平组(n=127)和低水平组(n=90)，评估不同水平sTWEAK对冠心病患者心血管事件发生的预测价值。
　　 1.2排除标准
　　 对目前文献报道、可能影响sTWEAK表达水平的疾病予以排除，包括:
　　 (1)自身免疫性疾病及使用免疫抑制剂者如系统性红斑狼疮、多发性硬化、多发性大动脉炎、结肠炎、皮肤炎症性疾病;
　　 (2)急性坏死性疾病如脑卒中、肢体坏死和其它组织器官坏死性疾病;
　　 (3)急慢性感染性疾病如脓毒血症(sepsis)、急性肺炎、出血坏死性肠炎;
　　 (4)恶性肿瘤:如肝癌、肺癌、脑小细胞胶质瘤等;
　　 (5)肾脏慢性疾病或损伤:如肾病综合症、肾小球肾炎、慢性肾功能不全;
　　 (6)凝血或溶血性疾病;
　　 (7)外周血管疾病;
　　 (8)伴有心功能不全，BNP＞1000pg/ml及超声心动图所测左室射血分数EF＜40％者;
　　 (9)伴有快速性心律失常、左室流出道受阻等引起的缺血性心脏病;
　　 (10)近期心脏手术患者（＜6月）。
　　 2.方法
　　 2.1血液标本收集
　　 采集冠心病患者和对照个体入院次日空腹静脉血11ml，干燥管静置10分钟后，提取血清，分装保存于-80℃的冰箱。
　　 2.2血清sTWEAK浓度测定
　　 采用人类TWEAK快速ELISA反应试剂盒（Bendermedsystems，产地:奥地利，LOT64629026）测定患者血清sTWEAK浓度，具体步骤为:在试剂盒微孔内加入蒸馏水100μl;空白对照孔内加入50μl蒸馏水，在其余试剂孔内加入25μl血清样品（1:4稀释）;盖膜后于室温下(18-25℃)震荡孵育3小时;用400μl缓释液冲洗所有试剂孔6次，每次10-15秒;加入TMB反应液100μl，室温下避光孵育10分钟，至标准孔1的620nm紫外线测得的吸光度达到0.9-0.95，加入终止液100μl，立即用酶标仪450nm紫外线下检测样本吸光度。
　　 2.3Gensini评分
　　 将冠脉造影术下所见冠脉血管狭窄程度分为0～24％、25～49％、50～74％、75～89％、90～99％、100％6个等级，分别评分为1、2、4、8、16、32分;将冠脉血管分为15段，各段赋予权重系数。用狭窄段或不显影段血管系数乘以狭窄程度分值，最后求得所有狭窄段分值的总和即为Gensini评分。该评分用以量化冠脉病变严重程度。
　　 2.4随访
　　 设计随访表格，对纳入研究的冠心病患者门诊随访或电话随访，调查项目包括年龄、性别、职业、居住地、民族、吸烟史、家族史等一般项目;调查患者高血压、高脂血症、糖尿病及它们的控制情况，调查出院后随诊情况和服药情况。随访终点事件定义为心血管事件，包括:心源性死亡、再发急性心肌梗死、必须住院治疗的再发心绞痛。随访时间为2年。
　　 2.5其他临床指标
　　 血液白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(Plt)、血清低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、载脂蛋白A(Ⅰ)(ApoA(Ⅰ))、脂蛋白(a)(Lp(a))、C反应蛋白(CRP)的结果来自于临床血液生化检测。
　　 3.统计分析
　　 采用统计软件SPSS19.0进行统计分析，数据描述以均数±标准差（(-x)±s）或百分比构成表示。采用协方差分析研究年龄对冠心病临床分组和对照组血清sTWEAK水平的交互效应。方差分析采用Welch检验，组间多重比较采用Tamhane方法。采用Spearman相关和偏相关研究临床指标对sTWEAK表达的影响以及sTWEAK与Gensini的关系。采用校正性别的logistic回归ForwardLR法研究与AMI有关的因子，纳入标准α入=0.05，排除标准α出=0.10。采用ROC曲线和Kaplan-Meier生存分析研究冠心病心血管事件发生风险，用对数秩检验(log-ranktest)对不同组的生存曲线进行比较。用x2检验比较不同水平sTWEAK组的心血管事件发生率。显著性水平α=0.05，P＜0.05为有统计学意义。
　　 [结果]
　　 1.sTWEAK血清浓度在AMI组为（1303.081±505.115）pg/ml;UAP组为（876.353±391.922）pg/ml;SAP组为（795.973±385.031）pg/ml;对照组为（810.352±260.255）pg/ml。sTWEAK血清水平在AMI组显著高于UAP组和SAP组有显著差异(P＜0.001)。UAP组、SAP组和对照组间无显著差异(P＞0.05)
　　 2.CHD患者中，sTWEAK血清浓度与Gensini评分显著相关(r=0.432，P＜0.001)。炎症指标CRP与sTWEAK无显著相关(P=0.209)，血脂指标TG、TC、ApoA(Ⅰ)、LDL-c、HDL-c、Lp(a)与sTWEAK血清浓度无显著相关性（P值均大于0.05）。
　　 3.在AMI组，sTWEAK与Gensini评分有显著相关性(r=0.535，P＜0.001)。炎症指标CRP与sTWEAK无显著相关(P=0.397)，血脂指标ApoA(Ⅰ)、TG、TCLDL-c、HDL-c、Lp(a)与sTWEAK血清浓度无显著相关性(P值均大于0.05)。
　　 4.sTWEAK、LDL-c可能与AMI有关。各指标OR、P以及95％CI分别为:sTWEAK的OR=1.003,P=0.003,95％CI=1.001～1.004;LDL-cOR=3.279,P=0.020,95％CI=1.201～8.951。
　　 5.sTWEAK对再发心血管事件的预测价值。ROC曲线AUC=0.650P=0.009。cutoff=951.183pg/ml（敏感度0.759;特异性0.638）。sTWEAK高水平组心血管事件发生率显著高于sTWEAK低水平组(x2=16.307，P＜0.001)
　　 6.sTWEAK高水平组患者平均再发心血管事件的时间为（20.228±0.863）月，而sTWEAK低水平组平均再发心血管事件的时间为（23.291±0.318）月。sTWEAK高水平组冠心病患者发生再发心血管事件的风险大于sTWEAK低水平组（log-rank检验x2=19.862;P＜0.001）。
　　 [结论]
　　 1.AMI组血清sTWEAK水平显著高于UAP和SAP组。
　　 2.在CHD患者及其中的AMI组中，血清sTWEAK水平与冠脉病变程度和范围的Gensini评分呈正相关，与CRP及血脂指标无显著相关性。
　　 3.血清sTWEAK、LDL-c可能与AMI有关。
　　 4.sTWEAK对冠心病患者再发心血管事件的预测价值。

目录

摘要

前言

第一章 不同类型冠心病血清sTWEAK表达及其与冠脉病变程度的关系

一、对象和方法

二、结果

三、讨论

第二章 sTWEAK与冠心病预后的研究

一、对象和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

综述

中英文缩略词表

成果

致谢

声明

统计学证明