临床常见细菌和真菌快速检测方法的初步研究

摘要

细菌和真菌感染是临床常见的感染性疾病，发病率和死亡率高，如果得不到早期的诊断和治疗，会严重危及患者的生命。传统的培养法、生物化学检测和免疫学检测等方法，缺乏敏感性和特异性，不能早期快速的诊断病原菌感染，因此，寻找快速的诊断方法至关重要。在本研究中，我们建立了分子生物学方法，用于临床感染中常见细菌和真菌的快速诊断，指导临床合理应用抗生素。
　　第一部分荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的建立
　　目的:
　　建立同时检测和鉴别革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌的TaqMan探针法荧光定量PCR，早期快速的诊断致病菌感染。
　　方法:
　　在GenBank数据库中查找20种细菌的16S rRNA基因序列和7种真菌的18S rRNA基因序列，应用ClustalX软件比对序列，找出各自的保守序列。使用Primer Express 2.0和Oligo 6.0软件，按照引物和探针设计的一般原则，在细菌的保守区筛选出细菌的通用引物和革兰分型探针，在真菌的保守区筛选真菌的通用引物和通用探针。革兰阳性探针和真菌探针的5'端标记荧光报告集团FAM，革兰阴性探针的5'端标记荧光报告集团HEX，它们的3'端均标记TAMRA荧光淬灭基团。细菌的扩增片段长度为229bp，真菌的扩增片段长度为276bp，引物和探针均在Invitrogen公司合成。优化荧光定量PCR反应体系，细菌的两个分型探针在同一个管中，真菌的探针在单独的管中，即同一个模板进行细菌和真菌的平行反应，每次反应均设置阳性对照、阴性对照和无模板的空白对照，所有反应均在ABI7500荧光定量PCR仪器上进行。检测11种革兰阳性细菌、9种革兰阴性细菌和7种真菌的标准菌株或者临床分离菌株，同时检测乙肝病毒DNA和人的基因组DNA，以观察所建立方法的特异性。使用标准菌株金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌、白色念珠菌进行普通PCR，分别构建阳性克隆质粒，定量后进行十倍的梯度稀释，调整质粒浓度为108copies/μl～100copies/μl。按照建立的反应条件用通用引物和特异性的探针进行荧光定量PCR，每个浓度做3次重复，评价方法的敏感性和线性关系。同时选取白色念珠菌3个不同浓度的定量标准质粒，连续三天进行重复检测，每次做三个复孔，通过计算其CT值的变异系数进行重复性和稳定性的评价。
　　结果:
　　用所设计的引物和探针检测20种细菌和7种真菌，11种革兰阳性菌在革兰阳性探针通道均有扩增曲线，在革兰阴性探针和真菌探针通道均无扩增曲线，9种革兰阴性菌在革兰阳性探针和真菌探针通道无扩增曲线，在革兰阴性探针通道有明显的扩增曲线。使用细菌菌株DNA、病毒DNA和人基因组DNA作为模板，加入真菌的通用引物和通用探针，检测结果均是阴性，真菌菌株仅能被真菌探针检测到，CT值从15.6到26.0，说明所设计的引物和探针均是特异性的。对构建的三种菌的质粒使用无菌去离子水进行十倍的梯度稀释，使用建立的方法进行检测，结果显示三种质粒在108～101copies范围内都有很好的线性关系。如果反应体系中仅加入细菌的两个探针，以CT值35为界限，最低可以检测出金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌10个拷贝的质粒DNA。如果三个探针同时加入反应体系，最低可检测出102个拷贝的质粒DNA。真菌的107拷贝、105拷贝和103拷贝数的批间变异系数分别为2.47％、1.89％和2.28％，均小于5％，说明本实验建立的方法重复性和稳定性较好。
　　结论:
　　本研究建立的多重荧光定量PCR方法，在单个样本中可以同时检测和鉴别细菌和真菌感染，敏感性高、特异性强，使用三个探针即可区分出革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌感染，可以快速应用于临床实验室诊断，为感染性疾病的早期诊断提供了重要依据。
　　第二部分荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的临床应用
　　目的:
　　评价所建立的荧光定量PCR方法检测临床标本的应用价值。
　　方法:
　　每份脑脊液标本的一部分进行3000rpm离心10分钟，上清接种肉汤增菌，沉淀接种于巧克力平板、血平板和真菌显色平板，在5％的CO2培养箱中37℃培养过夜。临床怀疑隐球菌感染的标本同时进行墨汁染色，在检验科常规室同时进行脑脊液常规分析。提取137份脑脊液标本的DNA，用建立的荧光定量PCR方法进行检测，并与培养方法和印度墨汁染色进行比较，结果使用SPSS13.0进行分析，统计使用x2检验即McNemar检验。
　　结果:
　　在137份脑脊液标本中，以CT值35为检测限，共有23例标本PCR检测为阳性，包括7份细菌阳性和16份隐球菌阳性，阳性率为16.8％。由于临床患者很多已经应用抗生素治疗，而且营养要求较高的菌很难培养出阳性，脑脊液细菌培养仅仅有4例标本阳性;而墨汁染色方法对专业技术人员的要求比较高，敏感性差，墨汁染色有10例阳性。以培养法和墨汁染色作为对照方法，PCR方法检测脑脊液样本的阳性率高于传统的对照方法，两者经统计分析有显著性差异(x2=5.82，P=0.012)。检测的灵敏度为92.86％，检测特异度为91.87％，约登指数为0.8473。
　　结论:
　　建立的荧光定量PCR方法用于临床标本的检测，操作简单，不仅应用于脑脊液感染的诊断，还可以应用于血液、胸腹水、尿液等体液标本，可以作为培养法的辅助手段，为临床医生早期用药提供依据。
　　第三部分荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因方法的建立
　　目的:
　　建立检测新型隐球菌荚膜相关蛋白基因的荧光定量PCR方法，为新型隐球菌的早期诊断和疗效判断提供重要方法。
　　方法:
　　在GenBank数据库中查找新型隐球菌荚膜相关蛋白基因的序列，使用Primer Premier 5.0软件设计一对引物，提取菌株的RNA并进行逆转录。PCR扩增CAP10基因的cDNA片段，目的片段长度为191bp，回收产物克隆至pMD18-T载体，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，构建质粒标准品，定量后进行十倍的梯度稀释;建立荧光定量PCR反应体系，分析扩增曲线和融解曲线，并评价方法的敏感性、特异性和重复性。
　　结果:
　　建立的荧光定量PCR方法检测荚膜相关蛋白基因CAP10质粒的敏感性为6.8×101copies，方法的特异性好，对脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉和大肠埃希菌均无扩增反应。检测同一个浓度的质粒，批内变异系数为0.65％，批间变异系数为2.45％，说明具有很好的重复性。
　　结论:
　　成功建立了荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因的方法，该方法重复性好，敏感性和特异性高，可用于新型隐球菌的早期诊断，也可用于脑膜炎预后的监测及疗效观察。
　　第四部分LAMP技术检测幽门螺杆菌方法的建立及初步应用
　　目的:
　　建立一种快速简单的检测幽门螺杆菌的方法，为探索临床常见的其他细菌和真菌的诊断方法奠定基础。
　　方法:
　　在GenBank数据库中查找幽门螺杆菌的16SrRNA基因序列，使用在线软件Primer Explorer 4.0设计一套引物，包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，使用Primer Premier 5.0设计一对PCR引物，优化反应条件，建立LAMP和普通PCR反应体系，比较两种方法检测幽门螺杆菌的敏感性和特异性，并评价了LAMP方法检测粪便模拟标本的敏感性。
　　结果:
　　使用LAMP方法可以在2小时内得到检测结果，加入核酸染料后阳性管为绿色，电泳后有明显的阶梯状条带。LAMP方法检测幽门螺杆菌的基因组DNA的敏感性为12pg，是普通PCR的10倍，对模拟粪便标本进行检测，检测敏感性为102CFU/ml;两种方法的特异性良好，均未检测出金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌。
　　结论:
　　成功建立了环介导等温扩增技术检测幽门螺杆菌的方法，敏感性高、特异性强，操作简单，不需要特殊仪器和设备，是一种很有前景的检测方法。

目录

摘要

前言

第一部分 荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的建立

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第一部分 荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的建立

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 荧光定量PCR同时检测细菌和真菌方法的临床应用

1 材料和方法

2 脑脊液标本PCR与培养结果

3 讨论

参考文献

第三部分 荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因方法的建立

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四部分 LAMP技术检测幽门螺杆菌方法的建立及初步应用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

综述 脑脊液细菌学基因诊断方法的研究进展

研究成果

致谢

声明

统计学证明