食管癌外周血循环肿瘤细胞检测方法和生物学特征的研究

摘要

研究背景与目的:
　　 食管癌是我国常见的恶性肿瘤，年死亡率居恶性肿瘤第四位，严重危害人类健康。其中，90％以上都是食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)。食管癌预后较差，5年生存率仅15％，手术切除后，2年生存率也不到30％。由于食管癌缺少明显的早期症状，并且缺乏明确的肿瘤标志分子，诊断时多为中晚期。因此，ESCC需要更好的诊断监测的方法和更多的诊断、治疗和预后相关的新分子靶点，提高ESCC的检出率和诊治水平。
　　 目前，检测肿瘤的方法主要有活组织病理检测及影像学检查等。但是，采集组织学标本创伤大，患者一般较痛苦，难以接受;而影像学检查无法检测到2毫米以下的肿瘤病灶。外周血取材方便，创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。外周血循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，CTCs)检测手段简便、易行、快捷，所以逐渐被人们所重视。
　　 恶性肿瘤患者血液中存在CTCs，也称为血液稀有细胞、肿瘤微小转移病灶、潜伏肿瘤细胞和循环上皮细胞(circulatingepithelialcell，CEC)等，是上皮来源的恶性肿瘤复发转移的早期事件，有关CTCs的理论已有很长时间。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，是肿瘤细胞播散种植生长的串联放大的瀑布反应。目前肿瘤的发现和诊断仍主要依赖于影像学检查及肿瘤特异性血清标志物的检测，不能及时发现肿瘤的转移和复发。由于肿瘤细胞经过血液循环系统转运播散至远端器官并且形成的明显转移灶是恶性肿瘤最主要的死亡原因，因此CTCs检测能够为肿瘤早期发现及转移复发监测提供一种有效手段。
　　 研究表明，CTCs数量及表型的改变可作为了解恶性肿瘤生物学特征及肿瘤进展的窗口，经过非侵入性的检测方法检测CTCs，为肿瘤早期筛查、肿瘤治疗的疗效评价、转移复发监测和预后判断等提供必要的信息，然而常规的检测手段很难发现这些细胞。目前，采用何种方法鉴定外周血中的CTCs，以及如何找到更多的CTCs特异性标志物，以提高CTCs检测的敏感性和特异性，成为该领域研究人员关注的焦点。
　　 本研究首先采用基于免疫磁珠的负性筛选食管癌外周血中CTCs的方法，分析CTCs与食管癌进展的关系。总结了CTCs与食管癌分期、肿瘤体积大小、淋巴结转移、远端转移以及患者生存时间等的联系。研究发现，细胞分化程度越差、TNM分期越高，外周血CTCs检出数量越多。CTCs水平高可能提示预后不良。外周血CTCs的检出率，有淋巴结转移的高于无淋巴结转移的，肿瘤浸润程度高的高于浸润程度低的，肿瘤分期高的高于肿瘤分期低的，分化程度差的高于分化程度好的。术前CTCs分组(以5为界值)及淋巴结转移是影响预后的显著因素，术前CTC≥5组和CTC＜5组相比，病人死亡的风险为3.078倍;淋巴结转移组和淋巴结未转移组相比，病人死亡的风险为3.331倍。
　　 同时，追踪了一例ESCC病例，动态监测不同治疗阶段患者外周血中CTCs细胞形态特征及数量变化，结合影像学及血清学标志，探讨其与治疗疗效及肿瘤进展的关系，进一步证实了CTCs对于肿瘤诊断和预后的价值。
　　 由于肿瘤具有异质性，在肿瘤的发生发展过程中肿瘤细胞会发生上皮间叶转变(epithelialmesenchymaltransformation，EMT)及间叶上皮转变(mesenchymalepithelialtransition，MET)等过程，细胞的各种标志会随着肿瘤的发生发展而改变。CTCs脱离原发灶后，在随后的变异中有部分细胞获得了高转移潜能，表现为上皮细胞表型丢失而间叶细胞表型增加。目前，CTCs的检测主要是基于分离和富集循环血液中的具有上皮细胞特性的肿瘤细胞。美国FDA于2004年批准的CellSearchProcedure，即采用抗上皮细胞标志EpCAM、CK8、CK18和CK19结合免疫磁珠富集外周血中CTCs。但是，由于大约20-30％的恶性肿瘤细胞本身不表达上皮标志或是表达水平很低，因而这一筛选方法会造成一部分肿瘤细胞检测不到。利用CTCs物理性质(如细胞大小)进行分离鉴定，也由于肿瘤细胞的异质性，细胞大小差异很大，存在特异性不高、富集效率低的问题。
　　 抗体研究是肿瘤的分子靶向治疗及肿瘤检测这一领域的基础和亮点。然而真正批准用于肿瘤检测和治疗的抗体相对较少。其中噬菌体抗体库就是一个筛选获得人源抗体的重要技术平台，也是获得人源抗肿瘤抗体的重要途径。此技术是将抗体多样性可变区基因组装到表达载体内，抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合表达到噬菌体颗粒表面，从而得到多样性噬菌体抗体的集合。噬菌体抗体库能将基因型与表型统一于一体，将选择能力与扩增能力偶联起来，在体外模拟体内的抗体生成过程，具有强大的筛选能力。
　　 本研究探索了通过人源大容量单链噬菌体抗体库筛选得到与食管癌细胞有结合活性的抗体。不仅对利用噬菌体抗体库筛选肿瘤细胞的方法策略进行了探讨，并且在筛选的基础上得到与食管癌细胞系特异性结合的抗体，有助于提高食管癌CTCs的检测效率，并为食管癌诊断和治疗提供候选分子。
　　 概括来讲，本课题以负性筛选CTCs研究为基础，通过外周血CTCs窗口，探讨CTCs数量和细胞形态的动态变化与ESCC危险分级、辅助治疗、复发和转移的关系;以食管癌细胞为靶，采用大容量噬菌体抗体库技术筛选抗食管癌CTCs的特异性单链抗体，为分离富集并鉴定食管癌患者外周血CTCs提供高灵敏度和特异度的检测方法和潜在靶标。本研究不仅对食管癌患者实现个体化诊疗具有重要意义，而且可能为食管癌生物治疗提供新的候选药物。
　　 方法:
　　 第一部分:本实验选取59例食管癌患者，应用免疫磁珠为基础的负性富集结合免疫荧光抗体鉴定的方法对其外周血CTCs进行检测。首先通过标记抗CD45的Miltineyi纳米磁珠与白细胞结合，通过强磁场时去除白细胞，富集到外周血稀有细胞;免疫荧光方法检测抗上皮标志CK8/18/19(+)，抗白细胞标志CD45(-)的细胞，细胞核DAPI染色阳性;细胞大小、细胞核大小形态等鉴定方法确定CTCs的数量及细胞形态。探讨CTCs和与患者临床病理参数的联系。
　　 第二部分:随访了一例晚期食管癌患者，作为个案报道。分别于患者不同治疗阶段富集和鉴定食管癌患者外周血中CTCs，观察该患者治疗前、后及随访过程中CTCs形态学和数量变化，评价CTCs与治疗疗效和疾病进展的关系。
　　 第三部分:用构建的人源天然大容量噬菌体单链抗体库，以三种人食管癌细胞系KYSE-170，KYSE-180和EC0156细胞等量混合为靶，分别采用2％多聚甲醛固定(PF)及活细胞直接筛选(NF)的方法，联合酸性洗脱液洗脱(s)及XL-Blue菌直接感染(c)的策略回收结合噬菌体，经“吸附-洗脱-扩增”4轮淘洗，通过细胞ELISA方法鉴定阳性噬菌体抗体。测定噬菌体抗体的相对亲和力并且制备可溶性抗体;进一步分析阳性抗体细胞特异性，用于食管癌外周血CTCs的检测。
　　 统计学处理:
　　 实验数据统计分析采用SPSS16.0软件包完成。论文第一部分，采用x2检验比较肿瘤不同分期、肿瘤大小、有无淋巴结转移、有无远处器官转移等因素下不同组别之间CTCs检出率的差别。跟踪随访观察病人的病情及预后，不同CTCs检出水平患者的生存率计算用Kaplan-Meier法，两组生存率比较用Log-rank检验，单因素死亡率比较采用x2检验，多因素生存分析采用cox比例风险回归模型(ForwardLR法)。论文第三部分，不同筛选方法筛选克隆阳性率、多样性率间比较用x2检验。均为双侧检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 第一部分:59例食管癌患者术前外周血中CTCs总检出率为79.6％(47/59)，所有病例共分离出CTCs细胞462个，平均7.83个(0-72)个，每毫升外周血约检出CTCs1.044个。细胞分化程度越差、TNM分期越高，外周血CTCs检出数量越多。CTCs水平高可能提示预后不良。不同组别CTCs的检出率比较结果如下:淋巴结转移组外周血CTCs的检出率高于淋巴结未转移组，两者差异具有统计学意义(x2=6.531，P=0.011);肿瘤浸润程度高的组较浸润程度低的组CTCs检出率高，两组差异具有统计学意义(x2=5.025，P=0.025);肿瘤分期高的组较肿瘤分期低的组CTCs检出率高，两组差异具有统计学意义(x2=5.025，P=0.025);分化程度差的组较分化程度好的组CTCs的检出率高，两组差异具有统计学意义(x2=4.883，P=0.027);CTCs与是否肿瘤远端转移虽然在统计学上没有显著性差异(x2=1.506，P=0.304)，但是有远端转移的组CTCs的检出率相差较大。CTCs的检出率与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的位置、吸烟与否没有统计学联系。手术前外周血中CTCs检出组及CTCs未检出组生存率差异具有统计学意义(x2=3.888，P=0.049)，CTCs未检出组生存率显著高于CTCs检出组;手术前外周血中CTCs＜5组及CTCs≥5组生存率差异具有统计学意义(x2=12.388，P＜0.001)，CTCs＜5组生存率显著高于CTCs≥5组;以术后CTCs检测数量分组，不同分组生存时间差异虽然不具有统计学意义，但是生存时间相差较大。采用影响生存时间的多因素Cox回归分析，术前CTCs分组(以5为界值)(B=1.124，P=0.010)及淋巴转移(B=1.203，P=0.003)是影响预后的显著因素，术前CTC≥5组和CTC＜5组相比，病人死亡的风险为3.078倍，总体相对危险度的95％可信区间为1.313～7.231;淋巴结转移组和淋巴结未转移组相比，病人死亡的风险为3.331倍，总体相对危险度的95％可信区间为1.493～7.430。
　　 第二部分:随访的患者自从第一次入院治疗到目前共3年的时间，T3N2M0，临床分期为Ⅳ期，共采集外周血8次，每次7.5ml，术前检测CTCs的数量为1个，术后7天检测CTCs的数量为14个。术后化疗共7次，治疗过程中，血清CA19-9、AFP等标记物保持正常，原发瘤免疫组化标记:肿瘤细胞CKAE1/AE3(+++)、CK17(++)、p63(++)、p53(++)、EGFR(+);CK7(-)、CK20(-)、CEA(-)。患者CTCs数量及细胞形态的动态变化与疾病的进展相关，并且与影像学结果相符。
　　 第三部分:通过大容量噬菌体抗体库共筛选获得61株抗食管癌细胞抗体。细胞ELISA结果显示，酸性洗脱液回收结合噬菌体后增加XL-Blue菌直接感染步骤，可以有效降低阳性噬菌体的丢失，筛选阳性率11.6％(61/525)。多数噬菌体抗体与三种食管癌细胞均有结合活性，有些抗体则表现出细胞系特异性。比较靶细胞的处理方法，PFc、PFs、NFc及NFs四组处理方法获得抗体阳性率比较，组间的差异具有统计学意义(x2=12.046，P=0.007)，其中NFs组的阳性率最高(16.8％)，PFc组阳性率最低(4.7％);测序结果NF组的抗体可变区基因多样性71.4％(5/7)，显著高于PF组14.2％(1/7)，两组多样性率差异有统计学意义(x2=4.667，P=0.031)。细胞免疫荧光和免疫细胞化学分析结果显示，具有不同可变区基因的噬菌体抗体主要定位于食管癌细胞的细胞膜，食管癌组织化学染色结果显示得到的抗肿瘤细胞的噬菌体抗体具有较好的肿瘤组织特异性。筛选到的噬菌体抗体与食管癌肿瘤细胞系有结合活性，而与白细胞不结合。
　　 结论:
　　 第一部分:比较患者临床资料分析后认为外周血CTCs同食管癌患者的诊断、治疗和预后有一定的联系，提示CTCs的检测可以辅助食管癌的临床诊断，对食管癌进行CTCs的研究有助于肿瘤的基础研究、评价手术治疗的效果和判断预后等。
　　 第二部分:食管癌外周血CTCs在手术前后、治疗前后的动态变化可能反映疾病的进展和治疗的疗效，并且基本与影像学检查相符，能够较早地反映疾病的进展及治疗的疗效，对有些血清肿瘤标志物为阴性的患者更有意义。外周血中检测到CTCs或者CTCs数量的变化反映了该患者的预后不佳，在治疗过程中监测CTCs的动态变化可能有助于指导患者的治疗，帮助其实施合适的个体化治疗方案。
　　 第三部分:以完整活细胞为靶，更易于保留肿瘤表面抗原的天然构像和多样性，通过具有良好多样性的大容量抗体库筛选获得的小分子抗体，在肿瘤示踪和靶向治疗中具有广阔应用前景。利用噬菌体抗体库筛选得到的抗食管癌细胞的抗体与食管癌细胞系有特异性结合，而与白细胞无结合，这样能够用来鉴定食管癌患者外周血CTCs，筛选出的单链抗体能够提供更多的抗体靶标并且用于肿瘤的免疫治疗与肿瘤的检测。
　　 本研究表明，外周血CTCs的检出与肿瘤的分期、浸润程度、淋巴结转移有密切的关系，并且术前CTCs的数目与患者的生存时间等相关，因此CTCs的检测可以指导肿瘤治疗、为判断肿瘤预后提供信息、评价肿瘤治疗效果、监测肿瘤转移复发，是具有可行性的诊断手段。本课题筛选得到的特异性抗体有望进一步提高CTCs检测的敏感性和特异性，使其在肿瘤诊治领域得到更为广泛的应用。
　　 主要创新点:
　　 1.本研究提示CTCs数目和形态改变与食管癌进展密切相关，动态监测外周血CTCs有助于疗效评价和预后判断，指导食管癌个体化治疗。
　　 2.采用大容量单链噬菌体抗体库筛选抗食管癌的特异性抗体，有助于进一步提高CTCs检测的敏感性和特异性。

目录

摘要

第一部分 检测食管癌外周血循环肿瘤细胞的临床意义

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

第二部分 食管癌循环肿瘤细胞监测肿瘤进展及治疗疗效的个案报道

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

第三部分 筛选用于鉴定食管癌循环肿瘤细胞的单链抗体

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

综述

缩略词简表

作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢

声明

统计学审稿证明