乳腺癌转移相关基因的生物信息学分析及功能研究

摘要

研究背景与目的:
　　 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤性疾病，远处组织器官转移与乳腺癌患者的治疗和预后有着密切的关系，也是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。目前，乳腺癌的预后指标主要以临床分期、病理类型和淋巴结转移等为主，但这些指标难以对肿瘤细胞的转移潜能或转移状态进行准确评估。大约有10％-15％的乳腺癌患者在首次确诊后3年或更长时间都会伴有其它严重疾病或发生远处转移，因此，乳腺癌患者终身都会经历乳腺癌转移的风险。转移与复发已成为乳腺癌病人术后生存的主要障碍，研究与乳腺癌细胞侵袭、转移相关的分子靶点对预防乳腺癌术后复发、提高疗效有重要意义。
　　 乳腺癌转移与其它恶性肿瘤一样是多基因、多因子相互作用和相互影响的复杂过程，也是肿瘤防治工作中面临的难题，只有有效控制、阻断肿瘤转移才可能实现肿瘤的治愈。肿瘤在演进过程中，一些肿瘤细胞具有了侵袭和转移能力，而这种转移表型的获得在很大程度上是由于肿瘤细胞内基因发生异常改变引起的。因此，从分子水平揭示肿瘤转移的本质，研究肿瘤转移相关基因成为肿瘤转移研究的热点。近年发展起来的基因芯片技术显示了其在分析疾病方面的优越性。
　　 基因芯片是21世纪生命科学领域的一项重要的技术平台，是筛选差异表达相关基因的有效手段，具有高通量和快速测量等优点。由于表达谱芯片在研究细胞基因表达模式上具有的优势，利用它可获取肿瘤细胞生长的各期以及肿瘤发生与发展过程中相关基因的表达模式变化，因此，基因表达谱芯片已广泛应用于肿瘤发生机制、早期诊断、肿瘤基因分型、指导治疗及评估预后等研究领域。随着表达谱芯片技术的广泛开展，产生了丰富的、海量的、复杂的生物信息数据。如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息，揭示其中蕴含的生命特征和规律，己成为限制基因芯片技术应用和发展的主要“瓶颈”。生物信息学是综合利用生物学、计算机科学和信息技术来揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘的一门交叉学科，它以生物芯片研究为基础，以序列比对、统计分析方法、可视化作图、生物聚类、通路分析及启动子预测等方法为手段，在分子水平进行数据挖掘、对疾病进行阐述，为肿瘤分子发病机理的研究开阔了新的研究思路，从而更加全面地从整体上对疾病进行研究。
　　 本研究以三组乳腺癌转移相关的基因表达谱数据(GSE2034，GSE2603，GSE12276)为分析材料，采用GeneSpring软件筛选乳腺癌原发瘤和转移瘤芯片数据的差异表达基因，再结合生物信息学工具和文献挖掘等方法对差异基因及其相互作用关系进行分析，从中发现新的乳腺癌转移相关基因COL1A1，最后再运用分子生物学实验对COL1A1基因进行功能研究，为乳腺癌转移的发病机制提供新的思路，也为转移性乳腺癌的分子诊断和个体化治疗奠定基础。
　　 研究方法:
　　 1.以乳腺癌转移相关的三组组织标本芯片表达谱数据(GSE2034:172例淋巴结阴性、未复发的原发癌样本和98例淋巴结阴性但发展成远处转移的乳腺癌样本;GSE2603:47例原发乳腺癌样本，24例转移乳腺癌样本;GSE12276:21例原发乳腺癌样本，160例转移乳腺癌样本）为研究材料，导入GeneSpringGX11.5软件筛选乳腺癌原发瘤和转移瘤的差异表达基因，然后交叉比较三组数据，得到共同上下调表达的乳腺癌转移差异基因。然后利用PANTHER、GATHER、GSEA、STRING和pSTIING等方法对差异基因进行生物学分析和网络图谱构建，再通过iHOP文献挖掘工具鉴定出新的乳腺癌转移基因。
　　 2.根据人COL1A1mRNA基因编码区序列，设计并合成针对COL1A1的2条小发夹RNA(shRNA)模板脱氧寡核苷酸序列(siRNA-1及siRNA-2)和1条作为负对照的无关序列(siRNA-scramble)。利用pSilencer2.1-U6neo载体质粒构建了2种特异性COL1A1siRNA质粒（pshRNA-COL1A1-1和pshRNA-COL1A1-2）及1种无关序列质粒pshRNA-scramble，通过阳性克隆酶切鉴定及DNA测序鉴定来验证构建的重组质粒是否符合实验要求。
　　 3.在阳离子脂质体介导下，用重组质粒转染COL1A1过表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，筛选出阳性稳定转染重组质粒的细胞进行克隆，分别采用RT-PCR和Westernblot技术检测COL1A1mRNA和蛋白表达的变化，用MTT比色法和平板克隆形成试验检测细胞增殖活性，流式细胞仪测定细胞周期变化和细胞凋亡情况，平板粘附模型检测细胞的粘附能力，采用运动小室实验检测细胞的运动侵袭能力。
　　 研究结果:
　　 1.乳腺癌转移相关基因的筛选及生物信息学分析
　　 利用GeneSpring生物分析软件共筛选出差异基因147个，其中表达上调基因93个，表达下调基因54个。运用GATHER、PANTHER等生物信息学工具对这些差异表达基因进行通路分析和功能注释，发现这些差异基因主要与细胞周期与增殖、细胞粘附、细胞迁移、血管形成及信号转到等生物通路有关。为进一步了解差异基因间的相互作用网络，用STRING在线工具对147个乳腺癌转移相关差异基因编码的蛋白质间的相互作用进行了分析，结果发现这些基因编码的蛋白间的相互作用主要集中在TNC、SPARC、PTGS2、TGFB2、NGF、CTGF、FN1、SMAD1、MEF2C、CSF1、CXCR4、MMP1、MMP2、MMP3、COL1A1以及ANGPL4等14个蛋白，再用pSTIING生物信息工具对这14个基因进行其物理相关和转录子相关网络图谱的构建，结果显示，在更为复杂的网络图谱中仍然可见其中9个差异基因（CXCR4、MMP1、MMP2、MMP3、CTGF、COL1A1、MEF2C、PTGS2及SPARC）在重要的节点位置，最后采用iHOP在线软件对重要结点基因进行文献挖掘发现，COL1A1基因可能与乳腺癌转移有关。
　　 2.特异性pshRNA-COL1A1表达载体的构建及鉴定
　　 1)构建的pSilencer2.1-U6-neo-shRNA-COL1A1重组质粒的阳性克隆酶切鉴定显示pshRNA-COL1A1-1、pshRNA-COL1A1-2以及pshRNA-scrmable的目的片段均已成功地克隆入pSilencer2.1-U6-neo载体。重组质粒的DNA测序鉴定结果显示，pshRNA-COL1A1-1、pshRNA-COL1A1-2以及pshRNA-scrmable在碱基序列、长度插入方向上与实验设计完全一致，符合实验设计要求。
　　 2)在阳离子脂质体介导下，用重组质粒转染COL1A1过表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，成功筛选出阳性稳定转染重组质粒的细胞株。
　　 3)RT-PCR方法检测结果:pshRNA-COL1A1-1和pshRNA-COL1A1-2组MDA-MB-231细胞COL1A1mRNA水平与pshRNA-scramble组相比显著降低(均有P＜0.05)，抑制率分别达到44.407±3.900％和63.050±3.131％，而pshRNA-scramble组COL1A1mRNA水平与control组比较无显著性差异。
　　 4)Westernblot方法检测结果:pshRNA-COL1A1-1组和pshRNA-COL1A1-2组的COL1A1蛋白水平与阴性对照组相比显著降低(均有P＜0.05)，抑制率分别达到45.495±2.711％和66.984±2.081％，空质粒组和pshRNA-scramble组COL1A1蛋白水平略有下降，但其对COL1A1mRNA的抑制率和control组之间无显著性差异(P＞0.05）。
　　 3.特异性pshRNA-COL1A1对乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学影响
　　 1)MTT法检测细胞增殖情况，与阴性对照pshRNA-scramble和control细胞相比，干扰克隆细胞pshRNA-COL1A1-2的增殖速度明显减慢并且呈时间依赖关系，有统计学差异(F=31.597，P=0.000)。流式细胞术结果显示各组细胞中G0/G1期和S期变化具有统计学差异(均有P＜0.05)，EIF4GI干扰后影响细胞的细胞周期正常移行，阻止G0/G1期细胞进入S期，造成pshRNA-COL1A1-2组G0/G1期细胞聚集，S期细胞减少。pshRNA-COL1A1-2组细胞与pshRNA-scramble组比较凋亡率显著升高(P=0.000)，而pshRNA-scramble组与control组相比凋亡率无显著性差异。平板克隆形成实验显示三组细胞的克隆形成率差异有统计学意义(F=601.181，P=0.003)，pshRNA-COL1A1-2细胞克隆形成减少(P=0.000)，control和pshRNA-scramble组差异无统计学意义(P=0.108)。综合表明COL1A1表达干扰后，MDA-MB-231细胞体外生长被显著抑制。
　　 2)平板粘附模型实验提示pshRNA-COL1A1-2组细胞粘附能力较其它两组明显降低（P=0.108）;Transwell运动小室实验检测显示，与pshRNA-scramble组与control组细胞相比，pshRNA-COL1A1-2细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少，差异具有显著性(F=427.574，P＜0.001)，三组细胞的侵袭能力也具有显著性差异(F=79.625，P=0.011)，pshRNA-COL1A1-2组细胞的侵袭能力显著降低，说明COL1A1表达沉默降低了MDA-MB-231细胞的体外粘附、迁移和侵袭能力。
　　 结论:
　　 运用基因表达谱数据分析工具、生物信息学工具及文献挖掘工具对乳腺癌转移有关差异基因进行了深入的生物信息学分析，成功筛选到9个与乳腺癌转移相关的基因，其中COL1A1基因为首次报道的乳腺癌转移相关基因;利用pSilencer2.1-U6/neo质粒成功设计并构建了针对COL1A1mRNA的特异性RNA干扰质粒载体pshRNA-COL1A1-2，建立了稳定转染pshRNA-COL1A1-2重组质粒的MDA-MB-231细胞株，在体外实验中证明了pshRNA-COL1A1-2能特异性下调MDA-MB-231细胞中COL1A1基因水平和蛋白水平，阻滞MDA-MB-231细胞于G0/G1期，显著抑制MDA-MB-231的生长、增殖、粘附和侵袭能力，促进MDA-MB-231细胞的凋亡，为RNAi治疗乳腺癌提供了一定的实验依据。

目录

摘要

前言

第一章 乳腺癌转移相关基因的筛选与生物信息学分析

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

第二章 COL1A1-siRNA真核表达载体的构建及鉴定

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 特异性COL1A1-siRNA对乳腺癌细胞生物学的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

全文小结

参考文献

英文缩写词表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学证明