三聚氰胺氰尿酸盐致SD大鼠肾脏损害的实验研究

摘要

研究背景
　　 在三聚氰胺被非法添加到宠物饲料、牛奶以及其它蛋白制品中造成2007年3月美国大量宠物中毒以及2008年9月中国近30万婴幼儿发生泌尿系结石及泌尿系异常等事件后，有关三聚氰胺对人体的毒性作用及其形成结石的机制引起了国内外的广泛关注。三聚氰胺和三聚氰酸都是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，都是重要的有机工业原料，广泛应用于粘合剂、涂料、纺织助剂等物质的生产中。三聚氰胺与三聚氰酸均是一种白色粉末，一般情况下理化性质稳定，微溶于水，基本无毒。三聚氰胺和三聚氰酸在哺乳动物体内绝大部分以原型通过泌尿系统排出，不会在体内蓄积，也不会转化为同系物。Melnick等的研究提示，实验动物长期摄入三聚氰胺或三聚氰酸可导致肾小管上皮细胞脱落、肾纤维化、膀胱上皮增生、膀胱结石，膀胱癌等。Dobson等的研究和Pushchner等人的研究均表明单独给予猫、狗、鱼、大鼠三聚氰胺或三聚氰酸不影响实验动物的肾功能更不会产生结晶，联合给予二者才会导致大量结晶堵塞动物肾小管从而发生急性肾衰竭，实验结果表现为高血肌酐、高血尿酸、高尿素氮，且病理解剖提示肾小管堵塞了大量结晶，同时发现其他器官未受明显影响，并通过检测发现肾组织中的结晶是三聚氰胺和三聚氰酸1:1结合的晶体。另外Dobson等人的研究还证明了三聚氰胺或三聚氰酸被单独摄入，在体内所能达到的浓度限制内是不会对肾脏细胞造成毒性作用的。在前期实验中，梁毅文单独用三聚氰胺或三聚氰酸灌胃的大鼠，均未得到肾结石模型，但联合灌胃的大鼠，在肾脏内发现了特异性晶体的存在，并经红外光谱证实该晶体为三聚氰胺氰尿酸盐。三聚氰胺氰尿酸盐简称MCA，是由三聚氰胺与三聚氰酸以1:1通过聚合反应，靠氢键结合的晶体。外观为白色结晶状的微细粉末，无臭无味，有滑腻感，难溶于水，可溶于甲醛、乙醇等有机溶剂。MCA主要作为一种阻燃剂应用于工业上。三聚氰胺氰尿酸盐的性质稳定且更难溶于水，实验显示三聚氰胺和三聚氰酸的聚合反应很快，几乎是瞬间完成，将这两种物质的澄清溶液混合后，溶液立即呈烟雾状，静置片刻，晶体下沉。主要原理为三聚氰胺氨基和三聚氰酸羧基的脱水反应。Kim等研究认为，三聚氰胺与三聚氰酸按1:1比例混合同时摄入，经胃酸作用后分别吸收入血，最终被运送至肾脏，在这里三聚氰胺和三聚氰酸结合生成三聚氰胺氰尿酸盐，而此晶体较大且不溶于水，故容易堵塞肾小管发生肾脏损害，肾小管及肾间质损伤是由于结晶体机械性梗阻所致。但是目前仍缺乏足够的实验证据说明为何三聚氰胺和三聚氰酸不在人体循环系统中沉淀，而是一直等到肾脏才发生反应。是三聚氰胺与其代谢产物在肾小管内所形成结晶的毒性作用导致了肾功能的损害，还是结晶造成的泌尿系统梗阻损害了肾脏功能？或者都有可能。
　　 三聚氰胺氰尿酸盐的性质稳定且急性毒性亦很低。苏联在19世纪80年代的一次研究中显示，三聚氰胺氰尿酸盐的毒性要大于三聚氰胺或三聚氰酸。对于老鼠与兔子，三聚氰胺氰尿酸直接进入胃中的半数致死量为每公斤4.1克，但透过吸收则为每公斤3.5克，三聚氰胺相比则分别为6.0与4.3克。然而目前仍然缺乏其对于肾细胞毒性的证据，本实验采用三聚氰胺氰尿酸盐连续灌胃给药的方法，建立SD大鼠泌尿系损害的动物模型进行研究，旨在探明三聚氰胺氰尿酸盐是否对肾脏有毒性作用，是否参与对泌尿系统的损害。
　　 研究目的:
　　 1、探讨三聚氰胺氰尿酸盐通过灌胃给药方法是否可以造成肾脏损害并诱发泌尿系结石的产生。
　　 2、探讨三聚氰胺氰尿酸盐通过灌胃给药方法是否具有肾脏毒性作用。
　　 研究方法:
　　 1、制作模型和分组
　　 150只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重(200±10)g，随机分为4个给药组和空白对照组，每组各30只。给药组分别给予三聚氰胺氰尿酸盐400mg(kg·d)、200mg(kg·d)、60mg(kg·d)、10mg(kg·d)。对照组则给予2ml无菌蒸馏水灌胃，每天一次，连续60天。
　　 2、指标的收集和检测
　　 连续饲养大鼠60天，用代谢笼收集前1周24h尿液，计算24h尿量，检测尿PH值和24h尿酸排泄量，将尿沉渣涂片检查;在实验过程中的4、14、31、45、60天分别随机处死6只大鼠做血液生化检测、计算肾体重比值;用外科显微镜观察双侧肾脏后，将其制作成HE病理切片，观察肾脏的病理改变及晶体形成。
　　 3、数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，以(x)±s表示。尿液数据采用重复测量方差分析，血液数据则采用析因方差分析。P＜0.05，差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、尿沉渣涂片
　　 对照组大鼠尿液无明显晶体及杂质（图3-2A）;各给药组第一天便可见到尿液排出的肾脏切片晶体相似的呈放射状同心圆形、淡黄色半透明晶体，并且晶体的数量、大小随着给药剂量、时间的增加而增加（图3-2B，C，D，E）;并且晶体有融合在一起增大的趋势，而且200mg/kg，400mg/kg组外周附生了一层淡黄色透明晶体，400mg/kg组更为明显（图3-2E，F）。
　　 2、尿液和血液生化结果
　　 与对照组比较，10mg/kg、60mg/kg、200mg/kg组大鼠的24h尿尿量增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中60mg组尿量增加更为显著(P＜0.05)，400mg/kg组尿量减少，第5天开始差异有统计学意义(P＜0.05);10mg/kg、60mg/kg、200mg/kg组尿液PH值与对照组尿PH值无明显差异，400mg组尿液PH与对照组PH之间存在差异(P＜0.01);各药物组24小时尿酸排泄量随时间延长及剂量的增加逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。（见表3-1,2，3）
　　 在给药各组在血液指标与对照组的比较中，60mg/kg、200mg/kg在第31天，血肌酐、血尿素氮及血清胱抑素才明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05);10mg/kg组大鼠在第31天、60mg/kg组大鼠在第14天，200mg/kg组大鼠在第4天血尿酸开始明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);400mg/kg组在第4天的时候血肌酐、血尿素氮及血清胱抑素明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，而血尿酸降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。（见表3-4，5,6,7,8）。
　　 3、肾脏大体标本改变
　　 肾脏剖面发现对照组大鼠肾脏表面光滑暗红色，肾脏解剖观察未见明显病理改变;在整个实验过程中，10mg/kg组大鼠肾脏与对照组比较没有明显变化;60mg/kg、200mg/kg给药31天后发现大鼠肾脏略有肿大，表面粗糙暗红色可见黄色斑点，肾皮质剖面红褐色，皮质和髓质结构清晰，布满沿髓线放射状排列的淡黄色颗粒。60mg/kg、200mg/kg给药60天，400mg给药4天后肾脏明显增大，外观呈灰黄色，包膜有许多散在黄色斑点，肾脏剖面呈灰白色，大量淡黄色颗粒沉淀，皮质和髓质结构模糊。(图3-1)
　　 4、肾组织病理改变
　　 正常组未见明显病理改变。10mg/kg组的大鼠的肾组织在整个实验过程中只有一只大鼠见明显晶体，但是肾小球完好（图3-2B，C）。60mg/kg、200mg/kg组的大鼠在灌胃第14天前，大鼠肾脏亦未见明显晶体，肾小球完好，仅见少量肾小管略有扩张、及上皮细胞肿胀。60mg/kg、200mg/kg组的大鼠在灌胃第31天后及400mg组的大鼠肾组织中均可见淡黄色、放射状的圆形同心晶体，或单独存在，或聚集成簇或成群，以远端小管较多，也见于近端小管、集合管、间质及被膜下，偶见于肾小球囊中，有的晶体在肾小管中表现为不规则的碎片;肾小球因为受压明显变小。此外，可见大量单核细胞、中性粒细胞及淋巴细胞在肾小球囊腔、肾小管及间质中，脱落的上皮细胞核形成管型。早期肾远曲小管和集合管内有大量放射状，淡黄色特异性双折射晶体，以及大量的炎症细胞。肾远曲小管肿胀、扩张、坏死和再生，肾近曲小管大多未受影响，肾间质发生严重水肿，大量的淋巴细胞及单核细胞浸润，以及皮质髓质的交界处发生出血，肾包膜下的血管周围炎症，纤维化和血管内蛋白性血栓形成，晚期肾脏纤维化更加严重，肾小管扩张明显，肾小管间隔临近肾脏组织受压缺血坏死并脱落，相邻的肾小管融合成较大囊腔，正常的组织结构消失，整个肾脏呈现肺泡样变化。随着剂量的加大以及给药时间的延长，对于肾脏的损害越大。见图(图3-3，4F，K，N，O)。
　　 结论:
　　 1、使用一定剂量三聚氰胺氰尿酸盐连续灌胃会导致大鼠的肾脏内会形成不溶于水的三聚氰胺氰尿酸盐晶体。此晶体能堵塞肾小管造成肾脏损害甚至急性肾衰竭;
　　 2、三聚氰胺氰尿酸盐连续灌胃在肾脏形成晶体前可以导致肾小球滤过功能受损，同时能影响尿酸的代谢;
　　 3、为肾结石造模以及降低血尿酸提供了一种新的物质，同时也为研究三嗪类化合物造成肾脏晶体产生提供了一个新的视野;
　　 4、提示食品卫生安全检测部门改进检测方法，不仅要更准确的检出食品及饲料中三聚氰胺、三聚氰酸的含量还要检测出三聚氰胺氰尿酸盐的含量。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

一、研究对象

二、主要实验仪器

三、主要试剂

四、实验方法

五、统计学处理

第三章 实验结果

一、大鼠一般情况

二、肾脏大体标本改变

三、尿液生化

四、血液生化

五、尿沉渣涂片

六、肾脏组织学改变及晶体形成情况

第四章 讨论

一、三嗪类化合物的相关研究

二、动物模型的建立

三、三聚氰胺氰尿酸盐对泌尿系的损害的研究

四、本实验存在的不足与缺陷

五、应用前景与展望

第五章 参考文献

第六章 附录

第七章 攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明