6-羟基多巴胺致偏侧帕金森病大鼠的CatWalk行为学研究

摘要

研究背景:
　　 帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一种常见于中老年人群的中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为肢体静止性震颤、运动迟缓和肌僵直三大运动症状。由于PD病因和发病机制尚不明确，尚无根本性的治疗方法。目前，所有临床治疗技术以控制症状、改善运动功能、延缓致残时间为目的。以左旋多巴(L-DOPA)为代表的内科药物治疗可改善PD早期运动症状，但随着病程进展，药物耐受情况日渐明显，异动症、开关现象等晚期并发症相继出现，因此需要新的干预手段。深部脑刺激术(deepbrainstimulation，DBS)，是通过立体定向手术，将刺激电极植入病人特定深部脑神经核团，对核团进行慢性刺激，调节引起症状的异常电活动，从而消除或改善患者症状，以达到临床治疗目的。高频电刺激丘脑底核(Subthalamicnucleus，STN)可改善晚期PD的大多数运动症状，并且具有可控、可逆、微创等较传统外科手术的明显优势，使其成为晚期PD的标准治疗方案。但是高频电刺激丘脑底核并不能改善PD的所有症状，尤其是对晚期PD的步态紊乱、平衡障碍等轴性症状疗效欠佳，后者是导致PD患者摔倒的高危因素，引起患者股骨颈骨折、脑卒中等一系严重并发症。因此，探索对晚期PD轴性症状具有治疗作用的新靶点是DBS研究的热点问题。
　　 脚桥核(Pedunculopontinenucleus，PPN)是位于中脑、桥脑交界处的神经元核团，是中枢运动中枢的重要组成部分。研究提示电刺激PPN可有效改善晚期PD的运动症状，尤其对丘脑底核电刺激无效的姿势不稳、步态障碍等为主的轴性症状有明显疗效。低频刺激脚桥核可改善晚期PD的轴性症状，但动物实验的研究结果间存在较大差异，甚至出现矛盾，究其原因可能在于目前尚缺乏统一的量化行为学指标，尤其是步态方面的量化研究。为此，本研究采用CatWalk自动步态分析系统检测6-羟基多巴胺(6-OHDA)致PD模型大鼠的不同时期的步态变化，并对其进行量化分析，探讨量化研究PD步态变化的可靠的行为学指标。
　　 目的:
　　 1.建立基于CatWalk自动步态分析系统分析正常大鼠步态的分析方法;
　　 2;研究偏侧帕金森病模型大鼠在CatWalk自动步态分析系统中的步态特点，探讨最佳的参数特征。
　　 方法:
　　 1.正常大鼠的CatWalk行为学研究采用6只正常近交系雄性SPF级Wistar大鼠进行行为学检查无明显异常后，实施CatWalk行为学检查及圆柱实验(Cylindertest，又称前肢不对称实验)。每只大鼠接受前期训练（该期间的数据不进行统计分析），采集基线值，其主要目的是:在尽可能减少食物引诱之外的其他干扰因素的情况下，使大鼠可以顺利通过CatWalk玻璃板，即在8s内不停顿、不回头地通过CatWalk玻璃板。CatWalk步态分析系统主要由含内置荧光灯的玻璃板、玻璃下方的高频摄像头及图像传输转换系统、计算机等硬件设施和自带软件组成。CatWalk步态采集，试验过程为:大鼠至少记录3次顺畅通过玻璃板，而且每次记录通过至少有10步。当大鼠顺利通过CatWalk时，大鼠爪印会因玻璃内的荧光灯发出的荧光发生反射，被下方的摄像头捕捉，从而传输到计算机，记录下来，然后进行离线或在线处理、分析。CatWalk系统根据每个爪印的位置、大小、压强及不同时间点爪印之间的相互关系，计算出步态的定量及定性参数，从而计算出步态的静态及动态指标。本实验关注CatWalk原始的、定量性爪印指标，包括:站立时间（s，站立期内爪印与玻璃板接触的时间），站立指数（衡量肢体离开玻璃板的速度），最大接触面积（cm2，爪印与玻璃板的最大接触面积），爪印长度（cm，爪印在水平方向上的距离），爪印宽度（cm，爪印在垂直方向上的距离），爪印面积(cm2，爪印与玻璃板接触的表面积)，最大压强（a.u.，爪印与玻璃板完全接触时的最大压强），最小压强(a.u.，爪印与玻璃板完全接触时的最小压强)，平均压强（a.u.，爪印与玻璃板完全接触时的平均压强），最大接触时最大压强(a.u.)，最大接触时平均压强(a.u.)，悬空时间（s，爪印离开玻璃板的时间），悬空时速度(cm/s，爪印处于悬空期的速度)，行走循环（s，站立期与悬空期时间总和）等。
　　 2.偏侧PD大鼠的CatWalk行为学研究采用18只正常近交系雄性SPF级Wistar大鼠进行行为学检查无明显异常，随机分为6-OHDA损伤组(n=12)、假手术组(n=6)，采用立体定向手术将6-OHDA溶液和等量生理盐水注入假手术组和6-OHDA组大鼠的左侧内侧纵束(MLF)。术前1周训练大鼠并CatWalk系统中采集行为学数据基线值，术后3d、1周、2周，依次进行圆柱实验，再将大鼠置于Catwalk自动步态分析仪中，记录其步态变化，离线分析相关数据。CatWalk实验方法同前。然后取所有6-OHDA组大鼠、假手术组大鼠2只进行免疫组织化学染色，检测黑质-纹状体多巴胺能神经元的凋亡情况。
　　 结果:
　　 1.正常大鼠的圆柱实验结果提示，左、右前肢差异无统计学意义，且不随时间变化（P＞0.05）。CatWalk自动步态分析系统的分析参数包括:爪印分析、步序分析(StepSequence)、BOS(BaseofSupport)、爪印位置(PrintPosition)支持力(Support)、时相分布(PhaseDispersions)和联结(Couplings)。爪印分析中有定性、定量分析;步序有6种，Wistar大鼠以AB为主;BOS分为前肢与后肢;爪印位置分为左肢与右肢;时相分布有对角线（右前肢-左后肢，左前肢-右后肢）、共侧（左后肢-右后肢、左前肢-右前肢）和同侧（右前肢-右后肢、作前肢-左后肢）;联结有对角线（右前肢-左后肢、左前肢-右后肢、右后肢-左前肢）、共侧（左后肢-右后肢、左前肢-右前肢、右后肢、左后肢）和同侧（右前肢-右后肢、左前肢-左后肢、左后肢-左前肢）。
　　 2.偏侧PD大鼠的CatWalk行为学特征，圆柱实验显示:立体定向术后，6-OHDA组大鼠的左、右前肢对比差异有统计学意义（P＜0.05），假手术组大鼠左、右前肢对比差异无显著性意义（P＞0.05）。CatWalk分析显示:假手术组大鼠手术后左、右肢体对比，各肢体的术前、术后对比中各指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。6-OHDA组大鼠手术后，左、右肢体对比中，双前肢的最大接触面积、爪印长度、爪印宽度和爪印面积以及双后肢的最大接触面积之间比较差异有统计学意义(P＜0.05);6-OHDA组大鼠各肢体的术前、术后对比中，右后肢的四项下降，左前肢的爪印长度、爪印宽度和爪印面积下降，右前肢的最大接触面积、爪印长度和爪印面积下降，四项参数在左后肢中仅爪印宽度下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 结论及讨论:
　　 1.CatWalk自动步态分析系统可以从多方面、定性、定量的对正常大鼠的步态进行分析。
　　 2.并非所有参数都是反映PD步态的合适指标，结合偏侧PD大鼠模型的特点，CatWalk参数除在假手术组中要保持稳定性，还应符合以下要求:A.PD模型成功后，左、右肢体对比有差异，这与经典的圆柱实验原理类似;B.PD模型术前、术后比较中有差异，而且不同侧、不同肢体间的情况不同，即该参数在毁损对侧有差异，且同侧无差异，并且在毁损对侧的前肢、后肢都有差异，这样就能具有更好的敏感性与特异性，从而很好地从行为学上定量反应PD模型中黑质-纹状体多巴胺能神经元死亡情况。结合本研究结果，只有最大接触面积符合要求，也就是说从制动期到推进期转折点时爪印与玻璃板的接触面积。爪印长度、爪印宽度和爪印面积虽然在术后2周左、右前侧肢体对比中有显著差异，符合要求A，与经典的圆柱实验结果一致。爪印长度与爪印面积虽然在毁损对侧的前、后肢体上均存在差异，似乎部分符合要求B，但是这2项参数在毁损同侧前肢也存在差异，所以不作为首选指标。爪印宽度在毁损对侧前肢有差异，但不能完全反应对侧后肢的运动情况;另外，爪印宽度在毁损同侧前、后肢体均存在差异，不符合要求B。综合CatWalk的各项参数，最大接触面积同时符合上述提到的2项要求，这与PD患者在起步、转身、有复杂思维活动时运动症状加重有某种意义上的联系，但具体机制尚不明确。总之，CatWalk是一种检测偏侧帕金森病大鼠模型的有效手段，最大接触面积可作为有效参数之一对PD步态进行定量分析。
　　 全文小结:
　　 本研究首先采用CatWalk自动步态分析系统分析正常大鼠的步态特征，验证了的该系统可以多角度、定性、定量化的测定Wistar大鼠的步态。Catwalk可对帕金森病模型大鼠步态的变化进行定量分析，其中最大接触面积可能是最佳参数之一，其为深入研究帕金森病提供了有益参考。

目录

摘要

前言

第1章 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 具体实验

1．4 统计学分析

1．5 参考文献

第2章 结果

2．1 正常Wistar大鼠的CatWalk行为学研究

2．2 偏侧帕金森病大鼠模型的CatWalk行为学研究

第3章 讨论

3．1 正常Wistar大鼠的CatWalk行为学研究

3．2 偏侧帕金森病大鼠模型的CatWalk行为学研究

3．3 小结

3．4 参考文献

全文小结

中英文缩略词对照表

综述

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明