拉米夫定耐药的慢乙肝患者救援治疗过程中YMDD变异的演化及其对治疗疗效的影响

摘要

研究背景:
　　 抗病毒治疗是慢性乙型病毒性肝炎(chronichepatitisB，CHB)治疗的关键。拉米夫定(LAM，lamivudine)是第一个被批准用于慢乙肝抗病毒治疗的药物，它能有效的抑制乙肝病毒的复制。从而显著的降低血清中HBVDNA(hepatitisBvirusDNA)的水平，促进HBeAg(hepatitisBeantigen)的血清学转换，改善肝脏的炎症活动，延缓或阻止肝脏疾病的进展，降低肝癌(HCC，Hepatocellularcarcinoma)的发生率。由于其相对较低的价格，拉米夫定仍然是很多病人进行抗病毒治疗的首选药物，特别是在发展中国家。但是长期治疗过程中产生耐药是抗病毒治疗的一个难题。拉米夫定治疗一年的基因耐药率是14-32％，治疗2年、3年和4年后分别上升到38％、49％和66％。有些病人在出现病毒学突破后发生肝炎的急性恶化，导致肝脏失代偿，甚至是死亡。耐药后继续拉米夫定的治疗将不能获得临床益处。所以及时进行救援治疗是至关重要的。
　　 阿德福韦(ADV，adefovir)是核苷类似物抗病毒药物的一种，无论体内研究还是体外研究都证实:阿德福韦除了能有效抑制HBV野生株复制外，对拉米夫定耐药的YMDD(tyrosine-methionine-aspartate-aspartate)变异株的复制也有较强的抑制作用，而且对变异株复制的抑制作用可能优于野生株。由于以上的特性，阿德福韦被广泛应用于拉米夫定耐药患者的救援治疗。聚乙二醇干扰素α-2α（派罗欣，Pegasys）是一种长效干扰素，其半衰期长，给药方便，优于传统干扰素。欧洲肝病指南建议聚乙二醇干扰素作为慢乙肝（不论E抗原阴性还是阳性）的一线用药，虽然聚乙二醇干扰素α-2a作为万能治疗方法仍然有一些未解决的疑问，但有研究显示聚乙二醇干扰素α-2a可能为拉米夫定耐药的患者提供了一种新的抗病毒治疗的选择。
　　 阿德福韦和聚乙二醇干扰素α-2a均可用做为拉米夫定耐药的救援治疗。但不论是哪种方法，其治疗疗效均不理想，总的来说表现为HBVDNA下降缓慢、耐药率升高、停药后快速反弹等。只有一小部分患者对救援治疗有良好的应答反应。对于应答不佳的这部分患者，不少研究曾从病毒学方面探索其应答不佳的原因。有研究报道拉米夫定耐药的慢乙肝患者在阿德福韦单药救援治疗过程中，大部分YMDD变异株在治疗48周内逆转为野生株。也有研究表明拉米夫定耐药突变的演化可能是影响救援治疗疗效的一个重要因素。但目前还没有系统的研究来阐明拉米夫定耐药突变的逆转在临床抗病毒治疗中的意义。而且，拉米夫定耐药患者在聚乙二醇干扰素治疗过程中YMDD变异的演化尚无报道。
　　 所以我们的研究目的是探讨YMDD变异的逆转对救援治疗疗效的影响;并观测在干扰素治疗过程中YMDD变异是否也会发生快速逆转。
　　 研究目的:
　　 1.研究阿德福韦单药治疗或聚乙二醇干扰素治疗过程中YMDD变异的演化;
　　 2.探讨影响YMDD变异逆转的因素;
　　 3.探讨YMDD变异的逆转对救援治疗疗效的影响。
　　 研究方法:
　　 1.样本来源
　　 样本来自一项随机对照临床试验(www.controlled-trials.com，ISRCTN79659320)。该临床试验的设计如下:入组的患者均经过INNO-LiPA耐药检测，证实为YMDD变异的拉米夫定耐药患者。所有患者均为HBeAg阳性，以2:1的比例随机分配到A（聚乙二醇干扰素α-2a组）、B（阿德福韦组）两组。A组患者给予聚乙二醇干扰素α-2a180μg/次/周治疗48周，停药后继续随防24周;B组患者给予阿德福韦10mg/次/天治疗72周;所有患者在前12周均联合使用拉米夫定100mg/次/天的治疗。由于部分患者血清样本不足或缺失，本实验最终纳入了124例患者。其中聚乙二醇干扰素α-2a组45例，阿德福韦组79例。
　　 2.HBVDNA抽提
　　 取基线、12周、24周、48周、72周等时间点的系列血清，使用DNA抽提试剂盒(QIAampDNABloodMiniKit)严格按照说明从血清（每个血清样本使用量为200μl）中提取HBVDNA以备下一步实验使用。
　　 3.HBV聚合酶基因的扩增和测序
　　 巢式PCR（Sugauchietal）扩增HBVRT区，使用第二轮PCR纯化产物进行直接测序(InvitrogenLtd.ShangHaiChina)。
　　 4.测序结果的分析
　　 从Gen-Bank中下载所有基因型的HBVDNA全序作为参考序列，使用CLUSTAL-W的方法将测序的结果与A-G基因型的参考序列进行同源性比对。用HBVS基因做进化树来进行基因分型。所有序列的比对均使用MEGA5.0软件分析包进行，序列峰图检验采用Chromas软件进行，RtM204V/I变异的判断采用Mutationsurveyor3.0软件识读并进行人工确认。
　　 5.统计分析
　　 所有数据均使用SPSS17.0统计软件(version17.0，SPSSInc.，Chicago，IL)进行分析，率的比较用x2检验或者Fisher确切概率检验分析。定量资料用两独立样本的t检验进行分析。累积YMDD变异逆转率计算采用Kaplan-Meier法，累计YMDD变异逆转率的比较采用log-rank(Mantel-Cox)检验进行分析。所有结果均采用双侧检验，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.救援治疗过程中YMDD变异的演化
　　 1.1救援治疗过程中YMDD变异的逆转率
　　 YMDD变异的逆转定义为在某个时间点，用直接测序法检测到病毒准种以HBV野生株为优势株。如果检测到野生株和变异株混合感染，则按照优势株的结果进行分析。聚乙二醇干扰素α-2a组患者12、24、48和72周的YMDD变异逆转率分别为:7％(3/45)、53％(24/45)、73％(33/45)、91％(41/45)。阿德福韦组患者12、24、48和72周的YMDD变异逆转率分别为:6％(5/79)、38％(30/79)、52％(41/79)、57％(45/79)。
　　 1.2YMDD变异的逆转和adefovir耐药突变的发生
　　 在救援治疗过程中，阿德福韦组患者有4例发生了A181T/V耐药突变，其中3例为A181T变异，1例为A181V变异，救援治疗1年的耐药发生率大概为5.1％。值得注意的是4例A181T/V耐药变异均发生在YMDD变异逆转后。
　　 1.3YMDD变异与补偿变异的同步逆转现象
　　 救援治疗过程中，rtL80V/I、rtL180M等补偿变异位点会随着YMDD变异株的逆转而消失。提示补偿变异与YMDD变异存在于同一条序列上。
　　 2.基线期影响YMDD变异演化的因素
　　 2.1rtL80V/I对YMDD变异逆转的影响
　　 按照基线期rt80位点的补偿变异情况将所有患者分为两组:rt80L组（66例）和rt80V/I组（58例）。12周、24周、48周和72周rt80L组的累积YMDD变异逆转发生率为6.1％(4/66)、45.5％(30/66)、65.2％(43/66)、75.8％(50/66);rt80V/I组的累积逆转发生率分别为6.9％(4/58)、41.4％(24/58)、53.4％(31/58)、62.1％(36/58)。两组比较无显著性差异(x2=0.694，P=0.405)。
　　 2.2rtL180M对YMDD变异逆转的影响
　　 按照基线期rt180位点的补偿变异情况将所有患者分为两组:rt180L组(40例)和rt180M组（84例）。12周、24周、48周和72周rt180L组的累积YMDD变异逆转发生率为7.5％(3/40)、50.0％(20/40)、67.5％(27/40)、75.0％(30/40);rt180M组的累积逆转发生率分别为6.0％(5/84)、40.5％(34/84)、60.0％(47/84)、66.7％(56/84)。两组比较无显著性差异(x2=3.098，P=0.078)。
　　 2.3治疗方法对YMDD变异逆转的影响
　　 聚乙二醇干扰素α-2a组(45例)在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为7％(3/45)、53％(24/45)、73％(33/45)和91％(41/45);阿德福韦组（79例）分别为6％(5/79)、38％(30/79)、52％(41/79)和57％(45/79)。两组比较有显著性差异(x2=3.876，P=0.049)。
　　 2.4不同的YMDD变异(YIDD、YVDD)对逆转的影响
　　 测序结果显示46例为YVDD变异，60例为YIDD变异，其余17例为YV/IDD混合变异。为了分析不同YMDD类型逆转率的差异，将这17例按照测序峰图主峰处理，其中7例以YVDD为主，按照YVDD处理;10例以YIDD为主，按照YIDD处理。最终YVDD共53例，YIDD共71例。YVDD组（53例）在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为7.5％(4/53)、50.9％(27/53)、71.7％(38/53)、79.2％(42/53)，YIDD组（71例）分别为5.6％(4/71)、38.0％(27/71)、50.7％(36/71)、62.0％(44/71)。两组比较无显著性差异(x2=2.509，P=0.113)。
　　 2.5常见补偿变异(rtL80V/I、rtL180M)的数目对YMDD变异逆转的影响
　　 按照基线期补偿变异位点个数将所有病例分为三组:A组13例:无补偿变异位点，B组81例:有一个补偿变异位点，C组30例:有2个补偿变异位点。A组(13例)在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为15.4％(2/13)、38.5％(5/13)、61.5％(8/13)、69.2％(9/13);B组（81例）分别为3.7％(3/81)、49.4％(40/81)、66.7％(54/81)、76.5％(62/81);C组（30例）分别为10.0％(3/30)、30.0％(9/30)、40.0％(12/30)、50.0％(15/30)。三组比较有显著性差异（x2=4.214，P=0.04）。
　　 2.6不同基因型对YMDD变异逆转的影响
　　 本研究患者均为B基因型和C基因型，其中B基因型32例，C基因型92例。B基因型患者（32例）12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为9.4％(3/32)、56.3％(18/32)、75.0％(24/32)、84.3％(27/32);C基因型患者(92例)分别为5.4％(5/92)、39.1％(36/92)、54.3％(50/92)、64.1％(59/92)。两组比较有显著性差异(x2=5.194，P=0.023)。
　　 2.7基线HBVDNA水平对YMDD变异逆转的影响
　　 根据基线HBVDNA水平将患者分为三组:A组39例:HBVDNA＜7.0log10IU/mL;B组54例:7.0log10IU/mL≤HBVDNA＜8.0log10IU/mL;C组31例:HBVDNA≥8.0log10IU/mL。A组(39例)在12周、24周、48周和72周的累积YMDD逆转率分别为7.7％(3/39)、48.7％(19/39)、66.7％(26/39)、74.4％(29/39);B组（54例）分别为9.3％(5/54)、44.4％(24/54)、57.4％(31/54)、68.5％(37/54);C组（31例）分别为0.0％(0/31)、35.5％(11/31)、54.8％(17/31)、64.5％(20/31)。三组比较有显著性差异(x2=6.295，P=0.043)。
　　 2.8YIDD与YVDD在选择补偿变异位点上的差异
　　 71例YIDD变异的患者有70％(50/71)伴有rtL80V/I变异，而53例YVDD变异的患者有15％(8/53)伴有rtL80V/I变异，两组比较具有显著性差异(x2=37.314，P＜0.001)。71例YIDD变异的患者有44％(31/71)伴有rtL180M变异，而53例YVDD变异的患者100％(53/53)伴有rtL180M变异，两组比较具有显著性差异(x2=40.078,P＜0.001)。
　　 3.YMDD变异的逆转对病毒学和生化学应答的影响
　　 为了分析逆转对应答的影响，将患者分为早期逆转组和非早期逆转组。早期逆转定义为:在救援治疗24周内患者体内的HBV准种从以YMDD变异株为主逆转为以野生株为主。而在24周内尚未发生逆转的患者归为非早期逆转组。最终，124例患者有110例可以纳入到此项分析，其中70例为阿德福韦治疗的患者，40例是聚乙二醇干扰素α-2a治疗的患者。剩余14例由于24周PCR阴性而不能纳入分析。
　　 3.1.阿德福韦治疗组YMDD变异的逆转对病毒学和生化学应答的影响
　　 基于上述定义，阿德福韦治疗的患者有30例为早期逆转组，40例为非早期逆转组。两组患者在性别、年龄、基因型、YMDD变异类型、补偿变异个数和基线期HBVDNA及ALT水平上均无显著性差异。治疗结束时早期逆转组和非早期逆转组患者HBVDNA下降水平有显著性差异（t=-3.255，P=0.002）。非早期逆转组的ALT复常率高于早期逆转组，虽然在统计学上没有显著性差异(x2=3.717，P=0.054)。另外，非早期逆转组治疗结束HBVDNA检测不到率显著高于早期逆转组（x2=4.057，P=0.044）。
　　 3.2.聚乙二醇干扰素α-2a组YMDD变异的逆转对病毒学和生化学应答的影响
　　 基于上述定义，聚乙二醇干扰素α-2a治疗的患者有24例为早期逆转组，16例为非早期逆转组。两组患者在性别、年龄、基因型、YMDD变异类型、补偿变异个数和基线期HBVDNA及ALT水平上均无显著性差异。治疗结束时早期逆转组和非早期逆转组患者HBVDNA下降水平有显著性差异(t=-0.883,P=0.383)。两组患者的ALT复常率无显著性差异（x2=1.778，P=0.182）。两组患者的HBVDNA检测不到率亦无显著性差异(x2=0.462，P=0.681)。
　　 结论:
　　 1.在阿德福韦治疗48周内，大部分拉米夫定耐药患者会发生YMDD变异株向野生株的逆转;在聚乙二醇干扰素α-2a治疗过程中也有同样的现象，证明干扰素与阿德福韦一样对拉米夫定耐药的HBV变异株亦无选择压力。
　　 2.与初治患者相比，拉米夫定耐药的患者阿德福韦治疗一年的耐药率明显升高，而且阿德福韦耐药突变都发生在YMDD变异逆转之后。
　　 3.补偿变异和YMDD变异在同一病毒株上，随着YMDD变异的逆转补偿变异也会发生逆转。
　　 4.影响YMDD变异逆转的因素有救援治疗方法、补偿变异的个数、基因型和基线期HBVDNA水平。总得来说，聚乙二醇干扰素α-2a治疗的患者YMDD逆转率更高;合并的补偿变异个数越多YMDD变异越不容易逆转，故补偿变异可以延缓YMDD变异的逆转;C基因型的患者YMDD变异不易逆转;基线期HBVDNA水平较高的患者YMDD变异不易逆转。
　　 5.YMDD逆转对病毒学和生化学应答的影响取决于救援治疗方法的不同。阿德福韦治疗过程中，YMDD的早期逆转不利于应答，提示发生早期逆转的患者要及时更改救援治疗方案。而在聚乙二醇干扰素α-2a治疗过程中，逆转对应答似乎没有明显的影响。另外，本研究结果提示聚乙二醇干扰素α-2a不适合用于拉米夫定耐药的救援治疗。
　　 6.YIDD和YVDD在补偿变异的选择上有明显差异。YVDD变异的病毒株均合并有rtL180M变异，少部分也合并有rtL80V/I变异;而YIDD变异的病毒株常合并rtL80V/I变异，少部分合并rtL180M变异，亦有一部分为rtM204I单点变异。

目录

摘要

第一章 研究背景

1．概述

2．慢乙肝患者抗病毒治疗的现状

3．耐药的救援治疗

4．救援治疗过程中YMDD变异的演化

5．研究目的

第二章 YMDD变异的演化及其对救援治疗疗效的影响

1．病例来源

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

全文总结

参考文献

致谢

声明

统计学证明