mTOR在TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞间叶样转化过程中的作用

摘要

晶状体上皮细胞(Lensepithelialcells，LECs)对晶状体的生长发育、维持晶状体的正常生理功能至关重要。LECs生长、增殖、移行、分化和分泌细胞外基质的等方面的异常是多种晶状体疾病特别是后囊膜混浊(posteriorcapsularopacification，PCO)的基础[1]。
　　 转化生长因子（transforminggrowthfactorβ，TGF-β）是上皮细胞向间叶样细胞转化(epithelialtomesenchymaltransition，EMT)的关键因子[2]，现有研究表明，在TGF-β的几种亚型中，TGF-β2在房水中含量最高，且能有效诱导人晶状体上皮细胞(HumanlensepithelialcellsHLECs)发生EMT[3]，目前已成为研究PCO时细胞模型的常用建造工具。
　　 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期进程和细胞生长增殖过程中发挥中心枢纽的作用[5]。此外，mTOR能够促进细胞的黏附与移行，参与调节上皮细胞向间叶样细胞转化[6]，但是，mTOR是否在LECs中存在表达，以及mTOR在HLECs向间叶样转分化过程中的活化水平及其是否参与调节HLECs间叶样转化至今尚未见报道。
　　 目的：
　　 明确mTOR在TGF-β2诱导的HLECs向间叶样细胞转化过程中的活化情况(磷酸化水平S2448-P，S2481-P)及作用。
　　 方法：
　　 1、建立TGF-β2诱导HLECs的EMT体外培养体系
　　 培养的HLECs-B3细胞换用无血清DMEM培养基后，加入TGF-β2，使其终浓度为10ng/ml，分别培养0h、1h、6h、12h、24h、48h，倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化，westernblot法检测HLECs上皮细胞标志物缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)、上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin，E-cad)和间叶样细胞标志物纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)的表达水平。
　　 2、westernblot法检测mTOR及其磷酸化水平（S2448-P，S2481-P）在TGF-β2诱导的HLECs的EMT过程中的动态表达变化。
　　 3、观察mTOR在TGF-β2诱导HLECs的EMT过程中的活化水平及其作用
　　 3.1、确定mTOR抑制剂雷帕霉素和KU-0063794的最佳作用浓度。
　　 将浓度梯度为0nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1000nM的mTOR抑制剂雷帕霉素和KU-0063794分别加入HLECs-B3细胞，培养24h后，倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化，westernblot法检测mTOR及其磷酸化水平(S2448-P，S2481-P)。根据二者对mTOR磷酸化水平的抑制情况以及细胞的生长状态，选择下一步实验中雷帕霉素和KU-0063794的作用浓度。
　　 3.2、观察mTOR在TGF-β2诱导HLECs的EMT过程中的活化水平以及mTOR抑制剂对TGF-β2诱导HLECs向间叶样细胞转化的影响。
　　 3.2.1、将实验分为以下组:
　　 对照组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后，换用无血清DMEM培养基后继续培养24h。
　　 TGF-β2组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后，换用无血清DMEM培养基后，终浓度为10ng/mlTGF-β2处理24h。
　　 雷帕霉素组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的雷帕霉素（最佳浓度由上述实验3得到）处理24h。
　　 KU-0063794组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的KU-0063794(最佳浓度由上述实验3得到)处理24h。
　　 雷帕霉素+TGF-β2组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的雷帕霉素预处理1h后，10ng/mlTGF-β2处理24h。
　　 KU-0063794+TGF-β2组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，最佳浓度的KU-0063794预处理1h后，10ng/mlTGF-β2处理24h。
　　 TGF-β2+雷帕霉素组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，终浓度为10ng/mlTGF-β2处理24h诱导HLECs，待HLECs间叶样转化后，再加入最佳浓度的雷帕霉素处理24h。
　　 TGF-β2+KU-0063794组:常规培养的HLECs-B3细胞系，生长至80％融合后换用无血清DMEM培养基，10ng/mlTGF-β2处理24h诱导HLECs，待HLECs间叶样转化后，再加入最佳浓度的KU-0063794处理24h。
　　 3.2.2、westernblot法检测mTOR的表达及其磷酸化水平(S2448-P，S2481-P)。
　　 3.2.3、westernblot法检测各组上皮细胞标志蛋白E-cad、Cx43，和间叶样细胞标志FN、α-SMA的表达水平。
　　 4、所有实验数据以(-x)±s表示，利用SPSS13.0软件进行统计学分析。本摘要“方法”部分“1”，“2”，“3.1”项中所述的westernblot实验均采用One-wayANOVA分析，实验组与对照组的两两比较采用Dunnettt法。本摘要“方法”部分“3.2.2”和“3.2.3””项中所述的westernblot实验采用One-wayANOVA分析，LSD法进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、在10ng/mlTGF-β2诱导HLECs间叶样转化过程中，随着培养时间的增加，HLECs从类椭圆形、多角形逐渐变为长梭形，且细胞间隙增大。与未经TGF-β2处理的HLECs相比，E-cad和Cx43分别于培养的第6h和12h时表达开始下降(E-cad:1.059±0.004,P=0.000;Cx43:0.477±0.076,P=0.032),FN和α-SMA于24h时表达开始增高(FN:0.872±0.134，P=0.011;α-SMA:0.516±0.049，P=0.000)。
　　 2、在10ng/mlTGF-β2诱导HLECs间叶样转化过程中，mTOR在2448和2481位点的磷酸化水平从培养的6h开始增高(S2448-P:0.542±0.124，P=0.006，S2481-P:0.519±0.122，P=0.006)，并呈时间依赖性的磷酸化程度上调，在24h时达到最高水平，但mTOR总表达量没有变化。
　　 3、mTOR抑制剂可阻断TGF-β2诱导HLECs的向间叶样细胞转化
　　 3.1、倒置显微镜下观察发现，使用雷帕霉素或KU-0063794处理HLECs，随着雷帕霉素和KU-0063794的浓度增高，贴壁HLECs数量减少，漂浮细胞增多，浓度为300nM的KU-0063794处理HLECs24h后，细胞密度稀疏，浓度为1000nM的KU-0063794处理HLECs24h后，细胞接近全部漂浮死亡。Westernblot显示10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能抑制mTOR(S2448-P，S2481-P)的磷酸化水平，且成一定的浓度依赖性，但各浓度的雷帕霉素和KU-0063794均不影响mTOR的总表达量。结合形态学，当KU-0063794浓度高于100nM时，贴壁HLECs稀疏，难以进行后续的实验处理，故选择100nM雷帕霉素和KU-0063794进行下一步实验。
　　 3.2、mTOR抑制剂可阻断TGF-β2诱导的HLECs向间叶样细胞转化
　　 3.2.1、mTOR抑制剂雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2诱导的HLECs内mTOR磷酸化激活
　　 与对照组相比，“TGF-β2组”的HLECs内mTOR被磷酸化激活(S2448-P为0.884±0.015，P=0.000;S2481-P为0.874±0.115，P=0.000)，而“雷帕霉素+TGF-β2组”和“KU-0063794+TGF-β2组”中，TGF-β2引起的HLECs内mTOR磷酸化激活被抑制，（“雷帕霉素+TGF-β2组”与“TGF-β2组”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;“KU-0063794+TGF-β2组”与“TGF-β2组”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。与“TGF-β2组”相比，“TGF-β2+雷帕霉素组”和“TGF-β2+KU-0063794组”中已完成EMT的HLECs中mTOR磷酸化仍被抑制（“TGF-β2+雷帕霉素组”与“TGF-β2组”相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;“TGF-β2+KU-0063794组”与“TGF-β2组”相比mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。但是，“TGF-β2+雷帕霉素组”的mTOR磷酸化水平高于“雷帕霉素+TGF-β2组”，“TGF-β2+KU-0063794组”的mTOR磷酸化水平高于“KU-0063794+TGF-β2组”(TGF-β2+雷帕霉素组与雷帕霉素+TGF-β2组相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000;TGF-β2+KU-0063794组与KU-0063794+TGF-β2组相比，mTORS2448-P及S2481-P:P=0.000）。KU-0063794对TGF-β2诱导HLECs中mTOR磷酸化的抑制效果强于雷帕霉素(“KU-0063794+TGF-β2组”与“雷帕霉素+TGF-β2组”相比以及“TGF-β2+KU-0063794组”与“雷帕霉素+TGF-β2组”相比mTORS2448-P、S2481-P:P=0.000）。
　　 3.2.2、雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制TGF-β2诱导的HLECs内上皮细胞标志物Cx43、E-cad的表达下降以及间叶样细胞标志物FN、α-SMA的表达升高。
　　 “对照组”HLECs中表达丰富的E-cad、Cx43以及微量的FN和α-SMA、“雷帕霉素组”或“KU-0063794组”中上皮/间叶样标志蛋白的表达水平与“对照组”无差别（“雷帕霉素组”与“对照组”相比，E-cadP=0.863，Cx43P=0.807，FNP=0.859、α-SMAP=0.782;“KU-0063794组”与“对照组”相比，E-cadP=0.773，Cx43P=0.834，FNP=0.395、α-SMAP=0.245)。“TGF-β2组”中E-cad、Cx43表达较“对照组”下降，而FN、α-SMA的表达升高(“TGF-β2组”与“对照组”相比，4种标志蛋白P=0.000)。“雷帕霉素+TGF-β2组”与“TGF-β2组”相比，E-cad、Cx43表达增多，FN、α-SMA表达减少(4种标志蛋白均为P=0.000);“KU-0063794+TGF-β2组”与“TGF-β2组”相比，E-cad、Cx43表达增多，FN以及α-SMA表达减少（4种标志蛋白均为P=0.000）。与“TGF-β2组”相比，“TGF-β2+雷帕霉素组”和“TGF-β2+KU-0063794组”中E-cad、Cx43表达量升高、FN以及α-SMA表达下降（与“TGF-β2组”相比，“TGF-β2+雷帕霉素组”和“TGF-β2+KU-0063794组”中4种标志蛋白均为P=0.000）。“TGF-β2+雷帕霉素组”中E-cad、Cx43的表达量少于“对照组”，FN以及α-SMA表达量高于“对照组”(4种标志蛋白均为均为P=0.000)。“TGF-β2+KU-0063794组”中FN表达量与“对照组”相当(FNP=0.071)，但E-cad及Cx43表达量低于“对照组”，α-SMA表达量高于“对照组”(E-cadP=0.017、Cx43P=0.001以及α-SMAP=0.000)。“TGF-β2+雷帕霉素组”与“雷帕霉素+TGF-β2组”相比，E-cad与Cx43的表达量少，而FN及α-SMA的表达量多(4种标志蛋白均为P=0.000)。“TGF-β2+KU-0063794组”与“KU-0063794+TGF-β2组”相比，E-cad表达量无统计学差异(P=0.063)，但Cx43的表达量减少(P=0.003)，FN和α-SMA的表达量增多(P=0.000)。“KU-0063794+TGF-β2组”与“雷帕霉素+TGF-β2组”相比，E-cad及Cx43的表达量增多，而FN与α-SMA的表达量减少(E-cadP=0.006，Cx43P=0.012，FN与α-SMA均为P=0.000)，“TGF-β2+KU-0063794组”中E-cad和Cx43的表达也高于“TGF-β2+雷帕霉素组”，FN及α-SMA表达量也低于“TGF-β2+雷帕霉素组”，(E-cad，FN及α-SMA均为P=0.000、Cx43P=0.014)。
　　 结论：
　　 1、10ng/ml的TGF-β2能有效诱导HLECs间叶样转化
　　 2、10ng/ml的TGF-β2诱导HLECs间叶样转化过程中，HLECs内mTOR磷酸化激活，但mTOR总量未受影响。
　　 3、10nM的雷帕霉素和KU-0063794均能有效抑制mTOR(S2448-P,S2481-P)的磷酸化水平，且成浓度依赖性，但均不影响mTOR总表达量。
　　 4、100nM的雷帕霉素和KU-0063794预处理HLECs均能有效抑制TGF-β2诱导的HLECs内mTOR磷酸化激活以及TGF-β2诱导的HLECs间叶样转化。100nM的雷帕霉素和KU-0063794能部分逆转TGF-β2诱导的HLECs间叶样转化，但使用100nM雷帕霉素或KU-0063794预处理再用TGF-β2诱导的HLECs比先用TGF-β2诱导再使用雷帕霉素或KU-0063794的细胞更能维持上皮细胞特性。KU-0063794抑制或者是逆转TGF-β2诱导的HLECs内mTOR(S2448-P,S2481-P)的磷酸化激活、以及HLECs间叶样转化的效果均强于雷帕霉素。

目录

摘要

第一章 前言

1．晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)：晶状体混浊的发生基础

2．转化生长因子-β2诱导LECs上皮-间叶样转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)：白内障研究的细胞模型

3．哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)：细胞新陈代谢的中心枢纽

4．新的假说：mTOR参与调控LECs向间叶样细胞转化

第二章 材料与方法

1．材料

2．方法

第三章 结果

1．TGF-β2诱导HLECs间叶样转化的体外培养体系的构建

2．mTOR及其磷酸化水平在TGF-β2诱导HLECs上皮-间叶样转化过程的动态表达

3．mTOR抑制剂雷帕霉素和KU-0063794的最佳作用浓度的选择

4．mTOR抑制剂可阻断TGF-β2诱导HLECs的向间叶样细胞转化

第四章 讨论

第五章 全文总结

参考文献

综述

在读期间发表的论文

致谢

声明

统计学证明