多西他赛对前列腺癌细胞株C-jun与雄激素受体相互作用的影响

摘要

研究背景和目的:
　　 前列腺癌(Prostatecarcinoma，PCa)是西方国家男性最常见的恶性肿瘤，美国男性因肿瘤导致的死亡率中，前列腺癌排第2位。流行病学统计，我国的前列腺癌发病率也在逐年上升，以上海市为例，1973～2000年，上海市男性前列腺癌的发病率增加了4.8倍，跃居男性泌尿生殖系肿瘤的第1位。目前在我国前列腺癌已位居泌尿系肿瘤的第二位，仅次于膀胱癌。尽管近年来前列腺癌的诊断和治疗取得了比较大的进展，如PSA筛查、前列腺活检穿刺、根治性前列腺切除、内分泌剥夺、放疗、化疗等综合诊疗手段有效的降低了前列腺癌的死亡率。
　　 但由于前列腺癌发病机制不清、病情隐匿、临床症状不典型，大约有1/3的病人在诊断时已经存在局部浸润或远处转移，失去了手术治疗的机会。目前50-70％晚期前列腺癌早期采用的标准治疗方法是雄激素消除治疗(Androgenablationtherapy)。
　　 不幸的是，雄激素阻断仅能暂时缓解疾病，中位缓解时间12-20个月，最终所有病人都将进展为雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independentprostatecancer，AIPC)，雄激素阻断疗法因此失效。如何对雄激素非依赖性前列腺癌进行进一步治疗，是临床上一个非常棘手的问题。
　　 雄激素依赖型前列腺癌在进行雄激素阻断的内分泌治疗后，逐渐将转变成雄激素非依赖型前列腺癌，从而导致内分泌治疗失败。虽然目前的研究还远远不能阐明其中的机理，但许多学者们都认为雄激素受体始终在转变中发挥着重要的作用。
　　 紫杉醇类药物被临床证实对前列腺癌有一定的疗效，研究表明，紫杉醇化疗可以提高雄激素非依赖性前列腺癌的生存率，降低患者血浆前列腺特异抗原(PSA，prostatespecialantibody)水平。多西他赛是紫杉醇类的代表药物，以多西他赛为中心的化疗方案，是晚期前列腺癌的一线化疗方案的金标准。
　　 多西他赛的抗癌作用机理尚未被完全阐明。一般认为，多西他赛抗肿瘤的机理在于其优先结合细胞内的β-微管蛋白，阻碍了GTP及一些辅助蛋白因子与β-微管蛋白的结合为位点。β-微管蛋白在缺少GTP和辅助因子时发生静态聚合，破坏了细胞正常的有丝分裂，使细胞分裂停滞在G2/M期，最终导致细胞的凋亡。
　　 但近年来的一些研究纷纷发现，多西他赛还在下调转录、细胞增殖、有丝分裂和肿瘤发生中起作用的某些基因，起到抗肿瘤作用。另有研究发现，多西他赛可以通过抑制雄激素受体来发挥对前列腺癌的治疗作用。这些研究提示我们，对微管系统的作用及对G2/M期的阻滞并不是多西他赛诱导细胞凋亡的唯一机制，可能有许多信号传导通路和机制参与紫杉醇诱导肿瘤细胞的凋亡。其中一个重要的信号传导通路就是JNK信号转导通路，研究发现，C-jun-氨基末端激酶(C-jun-N-terminal-kinase，JNK)被激活之后，可以通过激活内源性通路，激活BAX(Bcl-2家族的前凋亡蛋白)和Caspase-3（细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶），并磷酸化Bcl-2（抗凋亡蛋白）使其失活，使得促凋亡分子释放，从而导致细胞凋亡。
　　 原癌蛋白C-jun已被大量实验证实与许多肿瘤进展有关，其作为JNK的下游分子，可以被JNK磷酸化，其磷酸化位点位于C-jun氨基末端活性区Set63和Ser73，磷酸化C-jun可以增强其转录活性。C-jun是被认为是转录因子AP-1的组成部分，被认为是AP-1中起主要功能的重要组分。AP-1作为雄激素受体的转录因子，其活性又与雄激素受体基因调控能力紧密相关。在前列腺癌的发生发展中，雄激素受体发挥着至关重要的作用。
　　 本实验通过采用多西他赛处理体外培养的前列腺癌细胞株，通过westernblotting、DNA转染等方式，试图了解C-jun与AR在多西他赛作用下的相互作用，为探索多西他赛抗前列腺癌的机理和寻找前列腺癌多西他赛抵抗现象的原因提供线索。
　　 在之前的研究中，我们通过雄激素依赖型前列腺癌细胞株LNCaP和雄激素非依赖型前列腺癌细胞株PC-3在紫杉醇药物多西他赛处理下雄激素受体和C-jun蛋白表达等的对比，发现这雄激素依赖型和雄激素非依赖型前列腺癌细胞在多西他赛处理下，都表现出C-jun磷酸化增强的现象。转染了雄激素受体后的PC-3细胞获得了一定的抵抗多西他赛的能力。但由于两种细胞来源不同（LNCaP细胞来源于人前列腺癌淋巴转移灶，PC-3细胞来源于人前列腺癌骨转移灶），所表达的前列腺癌标志物也不尽相同，因此用两者分别模拟雄激素依赖型和雄激素非依赖型前列腺癌细胞，并在多西他赛处理下进行比较时，可比性欠佳。
　　 近年来国内外均有学者采用激素递减法或激素阻断法培养LNCaP细胞，从而获得稳定传代的非雄激素依赖的LNCaP细胞亚系，尽管LNCaP细胞表达的AR基因并非野生型，但LNCaP与其非雄激素依赖的细胞亚系仍是较理想的前列腺癌细胞研究模型。
　　 我们采用多西紫杉醇处理雄激素依赖型LNCaP前列腺癌细胞及其亚型比卡鲁胺抵抗型LNCaP-bic细胞（非雄激素依赖），采用荧光素酶分析检测AR及AP-1基因的表达，利用Westernblotting，免疫沉淀方法分析C-jun以及AR的蛋白表达和相互作用。试图进一步分析AR和C-jun之间的相互作用对前列腺癌多西他赛化疗结果的影响。
　　 二、研究目的
　　 本实验拟采用多西他赛处理雄激素非依赖型细胞株PC-3、雄激素依赖型细胞株LNCaP及其雄激素非依赖亚型细胞株LNCaP-bic，探索C-jun与AR在多西他赛处理的前列腺癌细胞中的相互关系。
　　 三、实验方法
　　 1、将PC-3细胞及LNCaP细胞，分别分为实验组（加入2.5nm多西他赛）和对照组(相应浓度的DMSO)，0.25％胰蛋白酶常规消化后以1.5×105/瓶接种于25cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时后，吸除原培养液，按分组加入相应药物处理，传代培养30天。用倒置显微镜观察并照相记录用药组和对照组的细胞形态变化。Westernblotting方法分析两组细胞中p-C-jun的表达。
　　 2、将PC-3细胞、LNCaP细胞消化收集，按5×103个细胞/孔接种于96孔培养板，在37℃，5％CO2、饱和湿度条件下培养。待细胞贴壁后，每孔进行换液。吸除原培养液后，分别加入含多西他赛10nmol（对照组）、10nmol的RPMI培养液180μl，另设只加培养液不加细胞和药物的为空白组。每组四个复孔。将96孔板移入CO2孵箱静置培养。MTT法测量细胞存活率。
　　 4、用脂质法将C-jun以及C-jun与AR共转染PC-3细胞株，westernblotting方法检测转染后C-jun和AR的蛋白表达。设立空质粒转染为对照组，用多西他赛10nm处理后，MTT法测量细胞存活率。
　　 5、Westernblotting分析多西他赛处理的PC-3和LNCaP细胞在各个时刻p-C-jun和p-JNK的表达。
　　 6、培养传代LNCaP细胞非雄激素依赖亚型LNCaP-bic细胞，用含萤火虫和海肾荧光酶素的ARE-luc报告基因质粒、AP-1-luc报告基因质粒转染细胞。转染24h后，细胞分为(1)对照组;(2)DOC组，多西他赛10nm处理48小时;(3)DHT组，双氢睾酮100nm处理48小时。裂解细胞，收集细胞提取物用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测（Promega公司），海肾荧光酶素活性作为内对照。分别以ARE和AP-1作为AR和C-jun的指示，荧光素酶方法分析LNCaP细胞和LNCaP-bic细胞在多西他赛处理下AR和C-jun基因的表达。
　　 7、Westernblotting方法检测多西他赛处理的LNCaP细胞和LNCaP-bic细胞PSA蛋白的表达情况，免疫沉淀法检测二者在多西他赛处理下C-jun以及AR的蛋白表达和相关关系。
　　 四、实验结果
　　 1、PC-3细胞和LNCaP细胞10nm多西他赛处理后，C-jun蛋白表达与未处理组无明显差别，但磷酸化C-jun(p-C-jun)蛋白表达明显增强。
　　 2、在同样浓度的多西他赛处理下，PC-3细胞的存活率与LNCaP细胞相比有显著性差异(P＜0.05)，转染C-jun基因后的PC-3细胞提高了对多西他赛的耐受性，而共转染C-jun/AR基因的PC-3细胞恢复了部分对多西他赛的敏感性。
　　 3、westernblotting分析提示在多西他赛处理的前列腺癌细胞中，p-JNK蛋白表达并没有显著性变化，体现出和p-C-jun蛋白表达增强不一致的特点。
　　 4、荧光素酶分析提示在多西他赛处理下，LNCaP细胞和LNCaP-bic细胞的AR和C-jun在基因表达水平上均增强。
　　 5、LNCaP-bic细胞在多西他赛处理下PSA表达强于其父代LNCaP细胞。免疫沉淀提示多西他赛处理后的LNCaP-bic细胞比起LNCaP细胞，C-jun与AR有着更强的相关性。
　　 五、结论
　　 在体外实验中，多西他赛可以采用JNK通路以外的方式磷酸化前列腺癌细胞中的C-jun，AR和C-jun可以提高前列腺癌细胞对多西他赛的耐受程度。
　　 多西他赛可以激活AR非配体依赖的转录功能，AR和C-jun之间的相互作用可能影响多西他赛对前列腺癌的化疗结果。

目录

摘要

第一部分 多西他赛诱导前列腺癌细胞中C-jun的磷酸化

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

参考文献

第二部分 多西他赛对前列腺癌LNCaP细胞株及其亚型中C-jun与雄激素受体相互作用的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间成果

声明

统计学证明