肝细胞的无血清培养研究

摘要

急性肝功能衰竭(acuteliverfailureALF)是一种严重的临床综合征，病情危重，进展迅速，预后凶险，病死率高。目前，唯一有效的治疗是原位肝移植。然而，由于供体器官缺乏、围手术期成本高和手术复杂、需长期使用免疫抑制剂等原因，病人往往在等待供体的过程中由于病情进展而迅速死亡，极大地限制了肝移植手术的广泛开展。基于此种前提下，生物人工肝支持系统逐步成为治疗肝功能衰竭的另一重要手段。生物人工肝能清除患者体内蓄积的各种有害物质，补充必需物质，改善内环境，暂时替代衰竭肝脏的部分功能，为肝脏再生创造条件，作为通向肝移植的桥梁，降低患者的病亡率，目前已成为仅次于肝移植手术治疗肝功能衰竭的最佳治疗手段。
　　 生物人工肝的核心为反应器中的肝细胞，生物人工肝对肝功能衰竭患者的肝支持作用几乎完全依赖于所用肝细胞的生物学功能。通常，肝细胞的生长有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分肝细胞不能增值。血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖。然而在生物人工肝的治疗过程中，由于反应器中残留血清的肝细胞与实验动物或病人血液直接接触，易引起过敏反应，影响治疗效果甚至导致实验动物死亡。所以，清除生物人工肝中残留的血清就显得尤为重要，也是生物人工肝面临的亟待解决的问题之一。
　　 同时经研究发现，细胞培养中使用血清还存在着多种缺点:首先，具有批间差异、不同批次血清间的生物活性和因子的不一致，导致产品和实验结果的重现性差，需要大量验证工作;其次，血清的来源不稳定，成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化;最后，存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染。
　　 因此，许多科学家开始进行无血清培养基的研究。无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因而无血清培养基得到了越来越普遍的应用，无血清细胞培养技术的研究日益得到人们的重视。
　　 综上所述，本研究将致力于肝细胞的无血清培养研究。通过无血清培养基培养C3A细胞系，使其与传统的血清培养，在细胞数量、活力和功能等方面，达到同样的效果，从而解决了血清的存在带来的种种弊端，同时为肝细胞用于临床治疗以及生物人工肝走入临床奠定基础。具体包括以下两部分研究内容:
　　 一:一种适合肝细胞生长的无血清培养基;
　　 二:四种无血清培养基培养C3A细胞的比较研究。
　　 第一部分:一种适合肝细胞生长的无血清培养基
　　 目的:
　　 研发一种适用于肝细胞(C3A)生长的无血清培养基，为肝细胞用于临床治疗以及生物人工肝走入临床奠定基础。
　　 方法:
　　 实验按细胞培养基的不同分为3组:分别为无血清培养基、完全培养基和基础培养基培养;采取逐步降低血清浓度的方法培养C3A细胞，使细胞耐受培养基的改变以及适应无血清培养基的培养;细胞稳定后，观察细胞的生长状态，细胞生长曲线和活力曲线观察，全自动生化分析仪测定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法检测白蛋白分泌量，实时荧光定量PCR检测基因水平的变化情况。
　　 结果:
　　 三组培养基培养的细胞形态均正常，细胞生长旺盛，胞浆透亮丰富，贴壁情况良好;细胞在接种24小时后开始增长，随着时间的推移，细胞数逐渐增多达到最大值后逐渐下降。实验组与阴性对照组，细胞生长至第五天到达最大值，分别为(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后开始下降;而阳性对照组，细胞生长至第七天达到峰值，为(3.50±0.060)×106。实验组和阳性对照组的细胞增长速度相近，细胞密度在培养周期内，除第六、七天(p=0.000，p=0.000)以外，无明显差异(p＞0.05)。而在培养的第三天至第八天，明显高于阴性对照组(P=0.000);培养的第五天开始，无血清培养基组和完全培养基组的细胞活力无统计学差异(P=0.429)并明显高于基础培养基(P＜0.001);无血清培养基组的尿素合成水平在培养的第二天起明显高于其余两组(P＜0.001)，而完全培养基组的尿素水平高于基础培养基组(P＜0.001);三组培养基组的白蛋白分泌量有统计学差异(P＜0.001)，但观察白蛋白分泌量，三者较为接近，说明无血清培养基能维持较好的细胞功能。Real-timeqPCR显示，无血清培养基组相对于完全培养基组，UGT、GST、AFP和ALB基因表达量无统计学差异(P=0.640，0.075,0.504,1.000)，而CK18、CK19和HNF4α基因表达量下降(P＜0.001)。
　　 结论:
　　 研制了一种适合于肝细胞(C3A)生长的无血清培养基，其与传统的血清培养在细胞数量、细胞活力以及细胞功能等方面能达到同样的效果，为肝细胞用于临床治疗以及生物人工肝走入临床奠定了基础。
　　 第二部分:四种无血清培养基培养C3A细胞的比较研究
　　 目的:
　　 本研究通过四种无血清培养基培养肝细胞(C3A)的效果对比，找出最适合于肝细胞的生长，并能最大发挥肝细胞功能的无血清培养基，为生物人工肝种子细胞的培养、筛选和应用以及生物人工肝走入临床奠定了基础。
　　 方法:
　　 实验按细胞培养基的不同分为6组:分别为A组:HepatoZYME-SFM培养基组;B组:William'sMediumE培养基组;C组:DMEM/F12培养基添加ITS、EGF、Nicotinamide、Asc2P、地塞米松、L-脯氨酸等组分;D组:自主研发无血清培养基;E组:完全培养基（阳性对照组）;F组:基础培养基（阴性对照组）:采取逐步降低血清浓度的方法培养C3A细胞，使细胞耐受培养基的改变以及适应无血清培养基的培养;细胞稳定后，观察细胞的生长状态，细胞生长曲线和活力曲线观察，全自动生化分析仪测定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法检测白蛋白分泌量，实时荧光定量PCR检测基因水平的变化情况。
　　 结果:
　　 六组培养基培养的细胞生长良好，生长曲线观察，细胞在接种24小时后开始增长，随着时间的推移，细胞数逐渐增多达到最大值后逐渐下降。A、B、C、D、F组，细胞生长至第五天到达最大值，分别为(1.40±0.060)×106、(2.48±0.041)×106、(3.01±0.050)×106、(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后开始下降;而E组细胞生长至第七天达到峰值，为(3.50±0.060)×106。C组细胞在培养初期生长较快，细胞数明显高于其他组(p＜0.001)，第四天开始，E组的细胞密度超过C组，结果有统计学差异(p=0.000);A组的细胞密度由第三天开始明显低于其他组(p＜0.001)，且一直保持较低水平，且一直保持较低水平;B、F两组的细胞密度接近，处于中间水平;D组细胞除第六、七天外，与E组细胞密度无统计学差异(p＞0.05);细胞活力观察，E组的细胞活力一直保持于最高水平，于培养的前三天明显高于其他五组(p＜0.001)，由第五天开始，B、F组细胞活力无显著性差异(p=0.910)而明显低于其他组(B与A、C、D、E组:p=0.005，0.007，0.000，0.001)，A组细胞活力处于中间水平;C、D两组的细胞活力处于较高水平，无统计学差异(p＞0.05);细胞功能检测，ALT漏出量呈现先下降后上升的趋势。F组的ALT漏出量由第三天开始明显升高并显著高于其余五组(P＜0.001)，最高达到(80.000±7.321)IU/L，细胞较早出现损伤;A组的ALT漏出量于第六天开始明显升高，并显著高于其余四组(P＜0.001)，最高达到(53.167±2.483)IU/L;B、C、D、E组的ALT漏出量较为接近，一直保持于较低水平，;而尿素检测结果显示，D组的尿素分泌量除第一天低于E组(p=0.000)外一直处于最高水平，显著高于其余5组(P＜0.001);E组的尿素分泌量于培养周期内，明显高于A、B、C、F四组(P＜0.001);C组的尿素分泌量明显高于A、B、F三组(P＜0.001)，而低于D、E两组(P＜0.001);A、B、F三组的尿素分泌量一直处于较低水平;白蛋白结果显示，D、E两组的白蛋白的分泌量虽然有显著性差异(P＜0.001)，但观察两组的分泌量，较为接近，且处于较高水平;A、C组的白蛋白分泌量较低;B组的白蛋白分泌量处于中间水平。荧光定量PCR结果显示:UGT在各组(A、B、C、D、F)中的表达较完全培养基组（E组）都无统计学差异(p=0.774，0.866，0.197，0.877，0.293);GST、ALB的表达除A组(p=0.000，0.000)外，其余各组与完全培养基组均无统计学差异(p＞0.05);AFP的表达在A、B、C、D、E组基本相同(p＞0.05)，而F组显著低于E组(p=0.041);A、D组的HNF4α表达量均低于完全培养基组(p=0.002，p=0.001)。
　　 结论:
　　 本课题组研制的具有自主知识产权的无血清培养基能通过各种机制在肝细胞培养过程中有效地代替血清成分，细胞生长良好，细胞形态、密度、活力、功能与含血清培养基基本相同，最适合于肝细胞(C3A)的生长，并能最大发挥肝细胞的功能，满足人工肝的治疗要求。为生物人工肝种子细胞的培养、筛选和应用以及生物人工肝走入临床奠定了基础。

目录

摘要

前言

第一部分 一种适合肝细胞生长的无血清培养基

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 四种无血清培养基培养C3A细胞的比较研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

综述

中英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明