蛇菰中多酚化合物的抗细胞粘附作用及其分子机理的研究

摘要

细胞粘附(celladhesion)和趋化(Chemotaxis)在维持机体正常生理和生化功能中起重要的作用。正常细胞的生长和组织分化需要细胞的粘附和趋化功能发挥作用。例如，细胞粘附和趋化参与了细胞的活化，参与了粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞在趋化因子的刺激下向炎症区域移动的过程，参与了免疫细胞的识别与应答反应，参与了组织器官的构建和修复等重要的生命功能过程。在病理情况下，细胞粘附趋化功能的紊乱或异常也在机体许多疾病的发生和发展中扮演重要的角色。细胞粘附和趋化参与了肿瘤的发生和转移，内皮细胞损伤、心肌梗塞、炎症、类风湿性关节炎、哮喘等疾病的发病过程。因此，抑制过度或病理性细胞粘附是治疗炎症、肿瘤、心血管等疾病的有效方法之一。
　　 细胞粘附和趋化主要通过细胞粘附和趋化因子来介导。粘附趋化因子是介导细胞和细胞之间以及细胞与细胞外基质之间通过相互作用而促进迁移和粘附的小分子多肽或糖蛋白。粘附分子按结构特点可分为整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族和钙粘蛋白家族等四大家族。细胞趋化因子是指能够刺激细胞趋化和迁移运动的一类细胞因子。根据其分子中的半胱氨酸保守性，趋化因子可分为α趋化因子（CXC亚家族），β趋化因子（CC亚家族），γ趋化因子(C亚家族)和δ趋化因子（CX3C亚家族）。所有的趋化因子都能趋化中性粒细胞和单核/巨噬细胞等炎性细胞向炎症区域移动，以增强炎性细胞的吞噬功能，并促进其释放炎症介质参与炎症反应。
　　 细胞粘附和趋化的调控是一个复杂的过程，其机理尚未完全明了。除受到粘附趋化因子的调控外，还受到机体许多其它因素如蛋白激酶和转录因子等的调控。蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)是细胞内重要的激酶，主要功能是将细胞外刺激信号转导至细胞内，通过催化蛋白质分子中丝氨酸/苏氨酸磷酸化（Ser/Thr磷酸化）来调控细胞的生长分化，增殖和代谢。此外，NF-κB作为核转录因子在免疫炎症反应中发挥重要的作用。无论是先天性免疫系统所需要的细胞因子，还是获得性免疫系统中T细胞和B细胞的活化都需要NF-κB信号通路的参与。在炎症性疾病中，NF-κB的激活导致的炎症因子持续分泌是发病的重要机制。蛋白激酶C、MAPK以及NF-κB都通过调控粘附因子、趋化因子、细胞因子的表达和分泌来调炎症反应。
　　 多酚类化合物(polyphenolcompounds)是指分子结构中有若干个酚羟基的植物成分的总称，其主要活性成分为多酚类物质。多酚类化合物种类繁多，且结构各异。至今已从植物等天然材料中分离出几千多种多酚类化合物，最常见的如黄酮类、单宁类和酚酸类等。多酚类化合物最显著的生物学活性是抗氧化作用以及其它生物学作用，因此，广泛用于与氧化损伤有关的慢性疾病和老龄性疾病，如心血管疾病（如动脉粥样硬化）、肿瘤、神经退行性变(如Alzheimerdisease)等疾病的预防和治疗。
　　 本文研究的多酚类化合物是从植物蛇菰(Balanophorajaponica)中分离的新的多酚类化合物。蛇菰为蛇菰科(Balanophoraceae)的一种双子叶寄生植物。在前期研究中，我们对化合物进行了活性筛选，发现部分多酚化合物具有抗肿瘤活性和抑制艾滋病毒的活性，但这些化合物是否具有抗炎和抑制细胞粘附的作用尚未进行研究和评价。因此，本文的研究思路是:以人肺癌A549细胞为体外炎症模型，研究从日本蛇菰中分离的多酚类化合物:1，3-二-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖(BJA3121)的抗细胞粘附作用;并进一步在细胞和分子水平上，从细胞粘附趋化因子MCP-1，ICAM-1，MMP-9，IL-8，IL-6的表达以及核转录因子NF-κB，P38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinases，p38MAPK)以及蛋白激酶Cε(proteinkinaseCε，PKCε)活性的变化来研究BJA3121抗细胞粘附作用的分子机理;为了排除BJA3121的抗细胞粘附作用与细胞毒性的关系，本文还研究了多酚化合物BJA312的细胞毒性，并与其类似物1，3，4-三-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖(BJA32515)和1,2，6-三-O-没食子酰基-β-D-吡喃葡萄糖(BJA32531)进行了比较。旨在研究和阐明蛇菰来源的多酚类化合物的抗细胞粘附作用及其作用的分子机理，以及发现新的具有抗炎作用的多酚类化合物。主要的实验方法，实验结果和实验结论如下:
　　 一.多酚化合物BJA3121抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导的人单核白血病THP-1细胞与人肺癌A549细胞粘附
　　 采用荧光显微镜方法测定荧光素标记的人单核白血病细胞系THP-1与贴壁生长的A549细胞粘附。多酚化合物BJA3121以40μg/ml分别预处理A549细胞6，12和24h后，对TNF-α(25ng/ml)刺激A549肺痛细胞4h后诱导的THP-1与A549细胞的粘附有显著的抑制作用。在荧光显微镜下，可观察到粘附细胞在药物处理的三个时间点都明显减少，而且处理24h后的作用强度大于6h和12h，作用呈现时间依赖性。当BJA3121以20，30和40μg/ml分别预处理A549细胞12h后，对TNF-α刺激A549肺癌细胞诱导的THP-1与A549细胞的粘附呈现剂量依赖性的抑制作用。
　　 二.多酚化合物BJA3121及其类似物BJA32531和BJA32515对人肺癌A549细胞和肝癌HepG2细胞生长的影响
　　 采用MTT和CCK-8方法测定多酚化合物抗A549细胞和HepG2增殖活性。结果表明，多酚化合物BJA3121以5.0，10.0，20.0和40.0μg/ml分别处理A549细胞24、48和72h后，均未观察到药物对细胞有生长抑制作用，说明BJA3121在有效抑制细胞粘附的剂量范围内对人A549细胞无细胞毒作用。但BJA3121及其类似物BJA32515和BJA32531在相同条件下，对人肝癌HepG2细胞显示细胞毒性。
　　 三.多酚化合物BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞的自细胞介素和粘附趋化因子基因的表达
　　 我们研究了多酚化合物BJA3121对细胞因子IL-8和IL-6以及粘附因子MCP-1，ICAM-1和MMP-9表达的影响。采用实时定量荧光PCR技术检测细胞因子IL-8和IL-6以及粘附趋化因子MCP-1，ICAM-1和MMP-9的mRNA表达。
　　 1.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞IL-8mRNA的表达
　　 采用实时定量荧光PCR技术检测A549细胞IL-8基因的表达。多酚化合物BJA3121以10，20，30和40μg/ml剂量和TNF-α（25ng/ml）一起预处理A549细胞6h，然后检测细胞中IL-8mRNA的表达。结果表明，在正常情况下，A549细胞中有少量IL-8mRNA的表达;而TNF-α单独刺激A549细胞6h后，细胞中IL-8基因的表达呈现显著性增加。BJA3121从10-40μg/ml的四个剂量均能抑制TNF-α诱导的A549细胞的IL-8mRNA的高表达，且抑制作用呈剂量依赖性。
　　 2.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞IL-6mRNA的表达
　　 采用实时定量荧光PCR技术检测A549细胞IL-6基因的表达。多酚化合物BJA3121以20和40μg/ml剂量和TNF-α(25ng/ml)一起预处理A549细胞6h，然后检测细胞中IL-6mRNA的表达。结果表明，在正常情况下，A549细胞中有少量IL-6mRNA的表达;TNF-α单独刺激A549细胞6h后，细胞中IL-6基因的表达呈现显著性增加。BJA3121在20和40μg/ml的两个剂量均能抑制TNF-α诱导的A549细胞的IL-6mRNA的过表达.
　　 3、BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞MCP-1mRNA的表达，但对ICAM-1和MMP-9mRNA的表达无影响
　　 采用实时定量荧光PCR技术检测A549细胞MCP-1，ICAM-1和MMP-9mRNA的表达。多酚化合物BJA3121以20和40μg/ml剂量BJA3121和TNF-α(25ng/ml)一起预处理A549细胞6h，然后检测细胞中MCP-1，ICAM-1和MMP-9mRNA的表达。结果表明，在正常情况下，A549细胞中均有少量MCP-1，ICAM-1和MMP-9mRNA的表达;而TNF-α(25ng/ml)单独刺激A549细胞6h后，细胞中三种因子的表达均显著升高。BJA3121在20和40μg/ml的两个剂量均能抑制TNF-α诱导的A549细胞的MCP-1mRNA的过表达，抑制作用呈剂量依赖性。但另一方面，BJA3121对TNF-α诱导的ICAM-1和MMP-9mRNA的表达无抑制作用。
　　 四.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞IL-8的释放
　　 采用人生物素化的IL-8抗体和HRP标记的亲和素的ELISA试剂盒检测A549细胞培养上清液中的IL-8水平。我们首先研究了TNF-α刺激A549细胞释放IL-8与TNF-α作用时间的关系。结果显示，无TNF-α处理的细胞上清液中IL-8的浓度为640±40pg/ml;而TNF-α以25ng/ml分别处理A549细胞3h、6h、12h、24h后，四个时间点的细胞上清液中IL-8的浓度分别为3898.3±300，34666.8±2212,43778.6±924和191255.6±9861pg/ml，有明显的时间依赖性。与对照组比较，各时间点都有显著差异。在药物的量效关系研究中，正常对照组的细胞上清液中IL-8的浓度为630±30pg/ml，TNF-α单独处理组的细胞上清液中IL-8的浓度为190455±9721pg/ml;而多酚化合物BJA3121以10，20，30和40μg/ml和TNF-α（25ng/ml）一起处理A549细胞24h后，四个剂量组的细胞上清液中IL-8的浓度分别200524±1087,166802±32092,103596±4709和83455±8337pg/ml。BJA3121在30和40μg/ml两个剂量组能显著抑制抑制TNF-α诱导的A549细胞的IL-8释放，具有显著差异。
　　 五.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞的NF-κB信号通路激活
　　 1.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞NF-κB亚基p65磷酸化
　　 在对照细胞未见p65亚基磷酸化，而TNF-α（25ng/ml）处理细胞30min能诱导NF-κBP65亚基磷酸化显著增加。BJA3121以10，20，30和40μg/ml预处理A549细胞1h，能剂量依赖性抑制TNF-α诱导的A549细胞p65亚基的磷酸化。
　　 2、BJA3121抑制TNF-α诱导的NF-κBp65从胞浆向细胞核转运
　　 与对照细胞比较，25ng/ml剂量TNF-α处理1h诱导细胞胞核NF-κBp65含量明显增加;BJA3121以10，20，30和40μg/ml预处理A549细胞1h后，显著抑制TNF-α引起的胞核NF-κBp65含量的增加，作用有剂量依赖性，但并不影响核内HistoneH3蛋白的含量，说明BJA3121抑制NF-κBp65由胞浆向胞核的转运。然后，我们进一步用细胞免疫方法证明BJA3121抑制TNF-α诱导的NF-κBp65由胞浆向细胞核的转运。首先，我们采用免疫荧光技术，应用荧光显微镜直接观察TNF-α诱导的NF-κBp65核转录与TNF-α诱导时间的关系。与对照组比较，TNF-α处理A549细胞1-4h均可观察到胞核红色荧光随时间增强，以处理1h的时荧光强度增加最明显，说明此时的核转录现象最为明显，表明TNF-α增加NF-κBp65由胞浆向细胞核的转运。而BJA3121在10，20，30和40μg/ml的剂量预处理细胞2小时明显减少NF-κBp65由胞浆向细胞核的转运。
　　 3、BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞胞浆Ⅰ-κB的降解
　　 与无药物和TNF-α处理的对照细胞比较，25ng/ml剂量TNF-α处理30min明显减少了A549肺癌细胞胞浆Ⅰ-κB的水平;BJA3121以10，20，30和40μg/ml预处理A549细胞1h后以及TNF-α刺激30min后，与TNF-α组比较，细胞胞浆Ⅰ-κB的量明显增加，表明BJA3121能明显抑制胞浆Ⅰ-κB降解。
　　 六、BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞P38MAPK信号通路的激活
　　 MAPK是细胞浆内的丝氨酸蛋白激酶，由p38MAPK，细胞外信号调节激酶1/2MAPK(ERK1/2MAPK)和C—Jun氨基末端激酶MAPK(JNKMAPK)三条信号通路来介导信号转导，其主要功能是参与细胞生长、发育、增殖、分化和死亡等生命功能的调控。当细胞受到刺激时，通过特定的信号通路激活MAPK蛋白激酶，活化后的蛋白激酶转移至核内激活相应的基因受体，进而促进相应基因的表达。我们采用Westernblot方法，研究了BJA3121对TNF-α诱导的A549细胞的P38MAPK，ERK1/2MAPK和JNKMAPK三条信号通路的影响。结果发现，与对照组相比，TNF-α（25ng/ml）处理细胞30min后，能诱导肺癌细胞磷酸化p38(p-p38)，磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白明显增加，而对细胞p38，ERK1/2和JNK蛋白表达没有明显影响。BJA3121以10，20，30和40μg/ml预处理A549细胞1h后，TNF-α再处理30min，能明显抑制p-p38MAPK的表达，作用有剂量依赖性，说明BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞P38MAPK的磷酸化。但是BJA311对TNF-α诱导的ERK1/2和JNKMAPK激活没有明显影响。
　　 七.多酚类化合物BJA3121对蛋白激酶活性的影响
　　 蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是一类依赖Ca2+和磷脂的蛋白激酶，在细胞跨膜信号转导的过程中发挥重要的作用。PKC通过催化蛋白质分子中丝氨酸/苏氨酸磷酸化（Ser/Thr磷酸化）来调控细胞的生长，分化，增殖和代谢。我们采用美国KINOMEscanTM公司的高通量筛选技术，对92种蛋白激酶的活性进行了筛选。我们发现，多酚化合物BJA3121在1μM剂量下，对激酶活性抑制率达到25％以上的激酶有18种。其中，对蛋白激酶Cε(PKCε，PRKCE)的抑制活性最强，达到70％。对其他17种激酶的抑制活性依次为:CSNK1D为62％;MAPKAPK2为48％;URKB为48％;JAK3为45.0％;ERBB2为45.0％;ZAP70为42.0％;GSK3B为40.0％;CDK2为39.0％;PIK3CG为37.0％;INSR为35.0％;FAK为32.0％;AURKA为31.0％;SRPK3为29.0％;KIT为28.0％;JAK2为27.0％;IKK-beta为26.0％;ACDK11为26.0％。
　　 八.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞PKCε蛋白的磷酸化
　　 体外激酶筛选的结果表明，BJA3121对PKCε激酶具有高选择性结合作用。为了进一步证明在TNF-α诱导的A549细胞粘附的炎症模型上，多酚化合物BJA3121也能呈现对PKCε的抑制作用，因此，我们采用Westernblot方法，研究了该化合物对细胞PKCε蛋白表达及其磷酸化水平的影响。结果显示，在正常状态下，细胞内存在低水平的PKCε蛋白磷酸化;而TNF-α(25ng/ml)分别处理细胞30min，1h和2h后，PKCε蛋白磷酸化水平随着TNF-α处理时间的延长而增加，说明TNF-α能诱导PKCε蛋白的磷酸化。当BJA3121以10，20，30和40μg/ml和TNF-α一起预处理A549细胞30min后，未观察到药物对PKCε蛋白磷酸化的抑制;但将BJA3121预处理的时间延长至2h后，再将和TNF-α共同作用的时间也延长至2h，结果显示，与TNF-α组相比，剂量为20，30和40μg/ml的BJA3121能明显抑制PKCε激酶蛋白磷酸化，有剂量依赖性。
　　 基于上述实验结果和文献分析，本文的结论如下:
　　 1.多酚化合物BJA3121在体外抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人单核白血病THP-1细胞与人肺癌A549细胞粘附。
　　 2.多酚化合物BJA3121在产生粘附作用的剂量下对A549细胞无细胞毒性，排除了药物的抗粘附作用与药物的细胞毒性有关系。
　　 3.多酚化合物BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞的细胞因子IL-8和IL-6以及粘附因子MCP-1基因的表达，但对ICAM-1和MMP-9基因的表达无影响。
　　 4.多酚化合物BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞对IL-8的释放。
　　 5.多酚化合物BJA3121通过抑制A549细胞NF-κB亚基p65磷酸化，NF-κBp65亚基从胞浆向细胞核转运以及细胞胞浆内Ⅰ-κB的降解来抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活。
　　 6.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路的激活。
　　 7.多酚类化合物BJA3121能抑制蛋白激酶Cε(PKCε)的活性。
　　 8.BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞PKCε蛋白的磷酸化。

目录

摘要

前言

第一章 实验材料与方法

第一节：仪器设备与主要试剂

第二节 细胞粘附的测定方法

第三节 研究药物对肿瘤细胞增殖作用的测定方法

第四节 RT-PCR方法检测细胞中白细胞介素和粘附趋化因子基因的表达

第五节 ELISA方法检测细胞培养液中IL-8水平

第六节 Western blot方法检测NF-κB和MAPK信号通路及激酶

第七节 细胞免疫方法检测NF-κB通路的激活

第八节 体外蛋白激酶激酶活性筛选的方法

第二章 实验结果

第一节 多酚化合物BJA3121抑制肿瘤坏死因子诱导的单核细胞与人非小细胞肺癌细胞的粘附作用

第二节 多酚化合物BJA3121，BJA32531和BJA32515对人肺癌A549细胞和肝癌HepG2细胞增殖作用的影响

第三节 BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞中自介素和粘附趋化因子基因的表达

第四节 BJA3121抑制TNF-α诱导的A549细胞IL-8的释放

第五节 BJA3121抑制NF-κB信号通路的活化

第六节 BJA3121抑制P38 MAPK信号通路的激活

第七节 多酚类化合物BJA3121对92种蛋白激酶激酶活性的影响

第八节 BJA3121抑制PKCE蛋白的磷酸化

讨论

结论

参考文献

缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学证明