大鼠纹状体内注射LV-Shh促进帕金森病模型大鼠神经再生

摘要

背景:
　　 帕金森病(Parkinsondisease，PD)是由于黑质多巴胺能神经元(dopaminergicneurons，DANs)进行性丢失，导致纹状体尾状核-壳核多巴胺(dopamine，DA)支配丧失，引起静止性震颤、肌强直和运动障碍等症候群，其发病率逐年增高，目前临床尚无特效疗法。主要的药物治疗大多是暂时缓解症状。左旋多巴及多巴胺能受体激动剂只能缓解疾病早期的运动障碍，长期服用可能会造成许多副作用，如左旋多巴诱导的运动障碍，“开关”现象，幻觉，嗜睡等。此外，非药物疗法如深部脑刺激虽然可以改善患者的运动障碍和生活质量，但具体的机制仍然不明确，且可能造成新的损伤。
　　 目前认为，细胞替代疗法(cellreplacementtherapy,CRT)可能是治疗帕金森病的最佳途径之一。它与以往传统的以缓解症状为主的治疗方法不同，细胞替代疗法是建立在更全面认识帕金森病的发病机制的基础上，以替代和修复变性和坏死的多巴胺能神经元为目的的疗法。而传统的外源性细胞替代疗法是采用胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)，神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)或者骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)进行移植，但研究表明这种移植方式尚面临来源受限、移植后功能差、低存活率、安全性不确定、临床可操作性差以及伦理学问题等，且移植后可致运动障碍，出现步态失调、跌倒、强直、甚至痴呆等非多巴胺能病理特征，植入的DANs存活率低，其内甚至出现Lewy小体。
　　 有鉴于此，本课题提出内源性CRT设想:在外源性因素的刺激下，宿主内源性神经干细胞或神经前体细胞增殖、迁移至损伤部位并原位分化为局部细胞，最终在结构和功能上恢复受损组织。在成体中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)存在有两个干细胞壁龛，分别是侧脑室脑室下区(subventricularzone，SVZ)和海马齿状回(dentategyrus，DG)。其内的神经干细胞终生持续处于增殖状态和神经元替代现象，并沿一定路径迁移。而且SVZ是成体神经系统中最大的干细胞库。因此，通过外源性的刺激营造SVZ内的NSCs(SVZ-NSCs)增殖、迁移至黑质-纹状体系统，分化为多巴胺能神经元并原位与周围的神经元整合而产生有功能的内环境，从而达到治疗的效果，这可能是治疗帕金森病的新思路。我们在文献调研中发现，Sonichedgehog(SHH)为影响神经系统发生、发育乃至中脑多巴胺能神经元形成的众多相关因子中最为关键的核心因子。
　　 SHH为Hedgehog家族成员之一，另外两个家族成员分别是deserthedgehog(DHH)和Indianhedgehog(IHH)。SHH是涉及在胚胎发育中重要的分泌性多肽之一。它最初是由脊索和底板所分泌，在胚胎发育过程中调节多种组织器官的形成和发生。它是CNS模式、增殖和细胞命运调节的关键性信号分子。SHH信号为出生后和成体脑内NSCs和神经发生的关键性机制，并维持终生。此外，文献也报道SHH具有促进多种神经元增殖、分化、促进轴突生长和轴突导向以及神经元的营养和保护等作用。其前体蛋白合成后自我催化裂解为分子量为19kD的N端片段(N-terminalproductofShh，SHH-N)，而SHH的功能区主要集中在N端，而非C端，且C端易造成整个蛋白肽链的断裂。因此，本实验的研究重点集中在SHH-N。
　　 目的:
　　 本课题拟在克隆出目的基因Shh-N并将其构建至慢病毒载体的基础上，以帕金森病大鼠为模型(立体定位注射6-羟基多巴(6-OHDA)损毁大鼠纹状体），将包装成功的病毒颗粒立体定位注射于大鼠纹状体的损毁区域，检测Shh在体过表达的情况，鉴定损毁区域神经修复（残存或新生神经元/神经胶质细胞，黑质-纹状体通路）情况，结合行为学观察，试图证实内源性治疗PD的可行性，并探讨其内源性机制。
　　 方法:
　　 1.Shh-N基因的克隆和载体构建:从9天胎鼠的脊索组织中提取的总RNA，通过巢式逆转录聚合酶链式反应(nestedRT-PCR)克隆出目的基因Shh-N并纯化，将其连接至慢病毒载体PCDH-MSC-T2A-copGFP-MSCV上构建重组体PCDH-Shh-T2A-copGFP-MSCV(LV-Shh)。通过稳定转染法包装生产慢病毒LV-Shh，实时荧光定量PCR(realtime-PCR)测定病毒滴度。
　　 2.帕金森病大鼠模型制作及实验分组:采用6-OHDA两点注射损毁纹状体的方法制作帕金森病的大鼠模型，根据不同的处理分为以下4组:
　　 1)实验组(LV-Shh):于24小时后在大鼠纹状体的同一坐标点注射慢病毒LV-Shh
　　 2)空载体组(LV):于24小时后在大鼠纹状体的同一坐标点注射慢病毒LV
　　 3)假手术组（Sham）:假手术处理
　　 4)空白对照组(Blank):不做任何处理
　　 每组依次分为三个时间点:2周(Ⅰ)，4周(Ⅱ)，8周(Ⅲ)。分别采用Westernblot和RT-PCR的方法检测Shh-N的表达情况。
　　 3.指标检测:在各个时间点处死前7天，各组大鼠均进行双侧纹状体内注射红色荧光金(Fluro-ruby,FR)。在三个时间点中的各组分别到达2周，4周，8周后，每组均采用颈背部正中皮下注射阿朴吗啡的方法进行旋转行为的检测。行为学检测结束后进行功能性检测，采用免疫荧光，Westernblot和红色荧光金示踪相结合的方法观察纹状体内注射LV-Shh对残存的DNAs和新生的神经元或神经胶质细胞以及内源性NSCs的影响。
　　 4.统计学分析:采用单因素的方差分析方法分析SHH-N在蛋白水平上各组过表达情况。采用析因分析方法分析纹状体内注射LV-Shh对PD大鼠旋转行为的恢复情况，FR示踪的黑质-纹状体系统神经轴突的改善情况以及纹状体TH阳性的突触和黑质TH阳性的神经元存活情况。同时采用单因素的方差分析方法分析8周各组蛋白表达情况。
　　 结果:
　　 1.成功构建慢病毒的重组体PCDH-Shh-T2A-copGFP-MSCV;生产的慢病毒浓缩后测得的病毒滴度为:2×107IU/ml。
　　 2.Shh/SHH过表达情况:nestedRT-PCR结果显示Shh在RNA水平上各时间点（2周、4周、8周）于各组均有表达;Westernblot结果显示在蛋白水平上于8周时的表达显著高于2周、4周、空载体组、假手术组以及空白对照组(P＜0.01)。
　　 3.纹状体内注射LV-Shh-N可以改善PD模型大鼠的行为:阿朴吗啡诱导旋转行为实验中，与2周和4周进行对比，8周的LV-Shh组的旋转行为显著改善(P＜0.01)。
　　 4.纹状体内注射LV-Shh-N可以恢复部分DNAs的功能:与2周和4周对比，8周的LV-Shh组纹状体内TH阳性的突触和黑质致密部TH阳性的神经元显著高于其他各组(P＜0.05)。
　　 5.纹状体内注射LV-Shh-N可以改善黑质纹状体投射系统的通路:红色荧光金(fluoro-ruby,FR)示踪神经轴突的实验中，与2周和4周进行对比，8周的LV-Shh组纹状体和黑质致密部FR标记的轴突的分布范围和平均光密度较其他各组均有显著提高(P＜0.05)。
　　 6.纹状体内注射LV-Shh-N可以诱导产生新生的NSCs和神经胶质细胞:与2周和4周进行对比，8周的LV-Shh组纹状体的损毁侧出现GFAP抗原阳性，其他组均未见;且Westernblot结果显示GFAP蛋白表达显著高于8周时间点其他各组(P＜0.001);而在8周的LV组损毁侧出现Nestin抗原阳性，其他组均未见;且Westernblot结果显示Nestin蛋白表达显著高于8周时间点其他各组(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 纹状体内注射LV-Shh-N可明显改善PD模型大鼠的行为;修复部分受损的黑质纹状体投射系统的神经通路;激活产生新生的NSCs和神经胶质细胞，对残存的DNAs起到神经营养保护的作用。

目录

摘要

前言

第一章 Shh-N基因的克隆和重组Shh-N慢病毒载体的构建

1．1 材料和仪器

1．2 方法

1．3 结果

1．4 结论

1．5 讨论

第二章 帕金森病模型大鼠纹状体内注射LV-Shh-N及其在体过表达

2．1 材料和仪器

2．2 方法

2．3 结果

2．4 结论

2．5 讨论

第三章 LV-Shh-N纹状体内注射促进帕金森病模型大鼠神经再生

3．1 材料和仪器

3．2 方法

3．3 结果

3．4 结论

3．5 讨论

参考文献

攻读学位期间成果

中英文缩略词表

致谢

声明

统计学证明