PPARγ在结缔组织病相关的肺间质病变中抗纤维化作用研究

摘要

研究背景：
　　 结缔组织病(connective tissue disease，CTD)累及肺部的病变多种多样，表现为气道、肺间质、肺实质、血管系统及胸膜等部位病变，其中间质性肺疾病(interstitial lung disease， ILD)是CTD累及肺部的主要并发症，又称弥漫性实质性肺疾病，具有相似的影像学、病理学及临床表现的肺功能紊乱性疾病。有文献报道CTD患者ILD发病率达25％，而10年生存率仅为60％，虽然不同文献报道发病率及病死率不同，但总体差异不大。CTD-ILD的治疗目前多使用激素及免疫抑制剂治疗，但总体治疗效果不佳且药物不良反应限制其长期应用。因此迫切需要我们深入了解CTD-ILD发病机制，以便寻求确切有效的治疗方法。
　　 ILD主要病理变化是肺泡慢性炎症、间质细胞过度增生及细胞外基质过度沉积。在纤维变性过程中存在大量促炎和促纤维化细胞因子参与，其中转化生长因子(transforming growth factorβ1，TGFβ1)能介导成纤维细胞的趋化、增殖及分化，促进细胞外基质合成、聚集及减少细胞外基质降解等效应，被认为是肺纤维化过程最关键细胞因子。而且我们前期实验已经证实CTD-ILD患者肺组织中TGFβ1的表达增加，因此阻断TGFβ1效应可能改善组织纤维化程度，达到抗纤维化效应。近年来体内外实验研究证实过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPARγ)的配体能通过干扰TGFβ1效应改善肺纤维化程度，但PPARγ干扰TGFβ1效应的具体机制仍不明确，可能是通过影响Smad复合物核内聚集、Smad2/3蛋白的蛋白后修饰及竞争辅活化因子或转录复合物与靶基因的结合，达到干扰TGFβ1促纤维化效应。本研究拟通过了解PPARγ配体罗格列酮对TGFβ1诱导的肺成纤维细胞的影响，观察α-SMA蛋白，Ⅰ型胶原和CTGF mRNA，乙酰化Smd3变化，初步探讨罗格列酮抗肺纤维化作用及可能机制。
　　 研究目的：
　　 1.通过收集CT引导下肺穿刺病人的标本，了解PPARγ在CTD-ILD患者肺组织的表达水平。
　　 2.原代培养人肺成纤维细胞，通过体外实验了解TGFβ1对人肺成纤维细胞分化的影响及PPARγ配体罗格列酮对TGFβ1诱导细胞分化是否存在抑制效应。
　　 3.通过体外实验，探讨PPARγ配体对TGFβ1诱导细胞分化影响的机制是否是通过与Smad3竞争结合P300实现的。
　　 研究意义：
　　 通过以上研究，探讨是否由于CTD-ILD患者肺组织中PPARγ表达降低，导致肺纤维化发生发展，了解PPARγ配体罗格列酮是否能通过干扰TGFβ1效应实现抗纤维化作用，这种干扰效应是否是通过与Smad3竞争结合P300，进而影响Smad3乙酰化，从而为CTD-ILD的基础研究提供一些理论依据，为CTD-ILD的治疗提供新的靶点。
　　 资料与方法：
　　 1.1研究对象与纳入标准
　　 收集2001-2010年在广东省人民医院风湿免疫科就诊的CTD-ILD行CT引导下细针穿刺肺活检术患者37例，女性29例，男性8例，平均年龄47.36±2.24岁，其中SSc6例，SLE5例，pSS5例，PM/DM10例，RA3例，血管炎4例，MCTD4例。选取20例不吸烟并无感染的肺癌患者远离癌旁的正常肺组织作为对照组，其中女性12例，男性8例，平均年龄45.62±1.12岁。实验组和对照组年龄及性别差异无统计学意义。
　　 CTD-ILD纳入标准:至少符合以下条件的中的①+⑤。①符合各类结缔组织病国际通用标准的诊断标准;②有咳嗽、咳痰、胸闷、胸痛及气促等呼吸道表现，排除阻塞性通气障碍者;③肺功能:限制性通气功能障碍、气体弥散功能降低;④影像学改变:高分辨率CT(HRCT)检查显示磨玻璃样、网格样、蜂窝样、纤维条索状影及囊性变等;⑤肺活检病理表现:符合2002年美国胸科学会与欧洲呼吸学会(ATS/ERS)制订病理表现，并排除妊娠、感染、药物、肿瘤及吸烟等因素。
　　 该研究得到当地伦理委员会批准，且取得所有参与者的知情同意。
　　 1.2实验方法
　　 1.2.1免疫组织化学检测肺组织中PPARγ表达:37例CTD-ILD和20例对照组肺组织，石蜡包埋肺组织，免疫组织化学染色。脱蜡至水后，用3％双氧水作用15min以阻断内源性过氧化物酶活性，1％Triton X-100透化细胞膜10 min，兔抗人PPARγ单克隆抗体(CST1∶200)，室温孵育60min，辣根酶标记抗兔二抗（基因公司）室温孵育30min，二氨基联苯氨(DAB)显色，苏木素复染。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。随机选取5个*400视野，用IPP软件，准确选取阳性表达区域，并计算阳性表达面积占该视野下肺组织的面积比。
　　 1.2.2细胞培养:选取年龄＜55岁、无感染、不吸烟患者癌旁正常肺组织，用组织块法行人肺成纤维细胞（primary human lung fibroblast，HLF）的原代培养。肺成纤维细胞置于37℃5％ CO2培养箱，用达氏修正依氏培养基(DMEM)[4.5g/L葡萄糖、10％胎牛血清(FBS)、0.01％青霉素/链霉素及含谷氨酰胺]。流式细胞术检测波形蛋白以确定肺成纤维细胞类型。第4～10代肺成纤维细胞作为实验对象。
　　 1.2.3四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性:以每孔5×104个细胞铺于96孔板，细胞处于指数生长期时加入TGFβ1和罗格列酮实验浓度(1、5、10、20及40μmol/L)于孔板，并设置空白对照，37℃、体积分数为5％ CO2培养箱培养72h后，加20ul MTT(5mg/ml)继续培养4h后，加200ul二甲基亚砜(DMSO)终止培养，37℃孵育30min，测560nm处吸光度（A）值。
　　 1.2.4蛋白印迹法(Westem-blotting)检测肺成纤维细胞中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达:①肺成纤维细胞按105～106个/孔铺六孔板，加入不同浓度的TGFβ1（0、1.25、2.5、5、7.5ng/ml）培养48小时后提取全蛋白，检测α-SMA②肺成纤维细胞按105～106个/孔铺六孔板，无血清培养12h后，更换含10％血清DMEM培养基，在加入TGFβ1(5ng/ml)之前2h加入不同浓度罗格列酮，分为TGFβ1(5ng/ml)组及TGFβ1（5ng/ml）+罗格列酮（1、5、10、20和40μmol/L）组，继续培养48h，提取全细胞蛋白。③肺成纤维细胞按105～106个/孔铺六孔板，无血清培养12h后，更换10％血清DMEM培养基，将细胞分为:空白组、TGFβ1(5ng/ml)组、TGFβ1(5ng/ml)+罗格列酮(20μmol/L)组及TGFβ1(5ng/ml)+罗格列酮(20μmol/L)组+GW9662(10μmol/L)组，培养48h，提取全细胞蛋白。用BCA(bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度。等量(10～15ug)上样，5％～10％聚丙烯酰胺凝胶（碧云天公司），电泳分离、电转及脱脂奶粉封闭后，聚偏二氟乙烯膜(PVDF)4℃分别孵育一抗α-SMA（1∶400博士德），羊抗兔IgG二抗(1∶2000)4℃孵育1h，增强化学发光法(ECL)显影、曝光。以甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，重复实验三次。用Image J软件测灰度值，进行统计分析。
　　 1.2.5实时荧光定量PCR:检索NCBI网站GenBank查询人Ⅰ型胶原、CTGF、GAPDH的mRNA序列，引物由捷瑞生物科技公司设计与合成。GAPDH序列:上游引物5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'下游引物5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'; CTGF序列:上游引物5'-TCGGGAAGGGGCAGTCAGGGCT-3'下游引物5'-CCAACCGCAAGATCGGCGTGTG-3';Ⅰ型胶原序列:上游引物5'-CTTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3'下游引物5'-GGCAAGGTGTTGTGCGATGAC-3'。人肺成纤维细胞按106个/ml铺板，无血清培养12小时后加药，在加入TGFβ1(5ng/ml)前2小时加入不同浓度的罗格列酮(1-40μmol/L)，继续培养48h， Trizol reagent（Invitrogen，USA）法抽提总RNA。分别用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒和SYBRTM Premix ExTaqTMⅡ试剂盒(TakaRa,宝生物工程(大连)有限公司）将RNA进行逆转录和实时定量PCR扩增反应，具体操作参照试剂盒说明书进行。数据处理:mRNA表达的计算以2-△△CT，△CT=CT（实验组-对照组）。
　　 1.2.6免疫共沉淀-免疫印迹法检测乙酰化Smad3表达及Smad3或PPARγ与P300结合情况:肺成纤维细胞按106～107个/瓶培养，按下列条件处理:(1)成纤维细胞中加入TGFβ1(5ng/ml)诱导60、90、180min后收获细胞提取全蛋白，免疫共沉淀检测乙酰化Smad3变化;(2)在成纤维细胞中加入TGFβ1(5ng/ml)和（或）罗格列酮(20μmol/L)，分为空白组、TGFβ1(5ng/ml)组、罗格列酮（20μmol/L）组及TGFβ1+罗格列酮组培养90min后，提取全蛋白裂解液检测Smad3与PPARγ结合P300情况。在(1)(2)条件下处理提取的全细胞蛋白中分别加入预沉淀抗体Smad3（1∶100 CST公司）、P300（1∶100 Invitrogen公司）4℃1h，加入洗涤后Protein G/A agarose（15ul/lug抗体）4℃孵育90min后，4℃14000g6 s离心弃上清，细胞裂解液（不含蛋白酶抑制剂）4℃14000g6秒洗涤混合物3次，弃上清余沉淀约20ul加蛋白变性剂沸水煮5min，-20℃保存行蛋白印迹，5％～10％聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离、电转及脱脂奶粉封闭后，PVDF膜4℃分别孵育一抗Acetylate-Lysine（1∶1000 CST公司）;PPARγ（1∶1000 CST公司）及Smad3（1∶1000 CST公司），羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶2000)4℃孵育1h，增强化学发光法(ECL)显影、曝光。以GAPDH为内参，重复实验三次。用Image J软件测灰度值，统计分析。
　　 1.3统计方法
　　 数据处理使用SPSS13.0软件进行分析。正态分布的计量资料用x±s表示，多组资料比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步的两两比较，采用LSD检验;非正态分布的资料用[M(QL～QU)]表示，多组资料比较采用Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whitney分析;计数资料比较采用卡方检验;检验水准p=0.05
　　 研究结果：
　　 2.1免疫组织化学法检测CTD-ILD患者肺组织中PPARγ的表达降低
　　 对照组肺组织中PPARγ主要表达于肺泡上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等中，且主要在胞核中表达。PPARγ阳性表达面积百分比在CTD-ILD患者肺组织中明显低于对照组[0.92％(1.44％)，3.50％(1.94％)]，差异有统计学意义(Z=-8.92，P＜0.01)。
　　 2.2 MTT检测细胞活性未受影响
　　 肺成纤维细胞暴露于TGFβ1和不同浓度罗格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）72h后，A值分别为（0.35±0.21，0.34±0.34，0.27±0.17，0.19±0.07，0.33±0.36），空白对照组为0.23±0.09，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明加入药物后细胞活性不受影响。
　　 2.3TGFβ1促进人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化
　　 与空白组相比，肺成纤维细胞经不同浓度的TGFβ1(0、1.25、2.5、5及7.5ng/ml)诱导48h后，发现随着TGFβ1浓度增加，α-SMA相对表达量增加，且具有浓度依赖效应，在TGFβ1浓度5ng/ml时达最佳刺激效应。α-SMA表达量变化在TGFβ11.25ng/ml组与空白组差异无统计学意义(P＞0.05)，在其余TGFβ1组差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。
　　 2.4 PPARγ配体能够显著抑制TGFβ1诱导人肺成纤维细胞分化。
　　 罗格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）干预后与对照组罗格列酮0μmol/L相比α-SMA相对表达量下降，罗格列酮1μmol/L组与对照组罗格列酮0μmol/L组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05);而罗格列酮浓度为(5、10、20及40μmol/L)与对照组罗格列酮0μmol/L组相比，α-SMA表达量变化差异有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01)。
　　 2.5罗格列酮抑制TGFβ1诱导人肺成纤维细胞分化的效应依赖于PPARγ
　　 在人肺成纤维细胞中罗格列酮（20μmol/L）能抑制TGFβ1(5ng/ml)诱导成α-SMA表达，但当加入PPARγ拮抗剂GW9662（10μmol/L）时，α-SMA相对表达量恢复， GW9662能够大部分抵消罗格列酮的这种抑制效应。在TGFβ1（5ng/ml）+罗格列酮（20μmol/L）组与TGFβ1(5ng/ml)组相比，α-SMA表达量相对降低，差异有统计学意义(P＜0.01);而TGFβ1+罗格列酮+GW9662与TGFβ1(5ng/ml)+罗格列酮(20μmol/L)组相比，α-SMA表达量增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 2.6 PPARγ配体抑制TGFβ1诱导Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达:
　　 罗格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）干预后与对照组罗格列酮0μmol/L相比Ⅰ型胶原、CTGF-mRNA相对表达量下降，罗格列酮（1、5、10、20及40μmol/L）组与对照组罗格列酮0μmol/L组相比较，Ⅰ型胶原表达量差异均有统计学意义(P＜0.01);而罗格列酮浓度为（1、5、10、20及40μmol/L）与对照组罗格列酮0μmol/L组相比，CTGF-mRNA表达量变化差异也均有统计学意义(P＜0.01)。
　　 2.7 TGFβ1增加肺成纤维细胞Smad3乙酰化水平
　　 在人肺成纤维细胞中加TGFβ1(5ng/ml)，在不同时间段用免疫共沉淀-免疫印迹法(IP-WB)检测乙酰化Smad3表达变化，发现肺成纤维细胞经TGFβ1诱导60、90及180min后与对照组相比，乙酰化Smad3表达增加，且在90min处达高峰，与空白组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.8罗格列酮通过干扰smad3与P300结合，来发挥抗纤维化效应。
　　 肺成纤维细胞在TGFβ1和（或）罗格列酮诱导下培养90min，TGFβ1组与空白对照组相比Smad3与P300结合相对增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，罗格列酮+TGFβ1组与TGFβ1组相比Smad3与P300结合相对减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，而PPARγ与P300结合相对增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 讨论：
　　 CTD-ILD临床发病率和死亡率较高，且缺乏有效的治疗方法，因此间质性肺疾病越来越引起人们重视。研究发现PPARγ具有多种生物学效应，不仅能促进脂肪及脂蛋白代谢，调节机体稳态，还具有抑制炎症反应及抗纤维化等作用。PPARγ发挥作用需要配体激活，因此，我们加入外源性噻唑烷二酮类的人工配体罗格列酮，了解PPARγ在CTD-ILD患者肺组织中抗纤维化作用及可能机制，以期寻求新的治疗策略。
　　 我们实验发现，CTD-ILD患者肺组织中PPARγ蛋白表达明显降低，并且PPARγ主要表达于肺泡上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等细胞中，这些细胞是肺组织内主要细胞成分，主要参与气体交换、组织损伤与修复及炎症反应等功能。其中巨噬细胞可以合成并释放溶酶体酶和致纤维化因子，刺激纤维细胞增生和胶原合成;上皮细胞对成纤维细胞增生和胶原合成有调节作用，同时也可以穿越基底膜到达纤维化病灶，经上皮-间充质细胞转化过程转化为肌成纤维细胞。有研究发现PPARγ能够诱导肺泡上皮细胞凋亡并抑制肺泡上皮细胞向间质细胞转化，抑制单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素-8及抑制单核细胞聚集，减轻炎症反应。活化的PPARγ还能够抑制成纤维细胞及肌成纤维细胞增殖、分化及细胞外基质产生。因此PPARγ表达下降在一定程度上加速肺纤维化发展，那么如果能够提高PPARγ活性，则很有可能减缓肺纤维化过程的发生发展。
　　 我们前期研究发现过度表达的TGFβ1在CTD-ILD的发生发展过程中都起到重要作用，本次实验结果显示，PPARγ的配体能抑制TGFβ诱导的人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞（Ⅰ型和Ⅲ胶原的主要分泌细胞）转化，MTT法证实此效应并非PPARγ配体本身毒性所致。与我们研究相似， Milam等和Genovese等发现PPARγ配体罗格列酮能抑制TGFβ1诱导的成纤维细胞增殖、转化，改善博来霉素诱导的小鼠肺损伤及纤维化。但目前关于PPARγ配体抑制TGFβ1促纤维化效应的具体机制尚不明确。
　　 我们还发现，PPARγ配体还能够显著抑制TGFβ1诱导的成纤维细胞COL1A1、CTGF mRNA表达。其中COL1A1 mRNA编码Ⅰ型胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，其过度分泌沉积导致肺瘢痕组织形成，促使纤维化发生。而CTGF是CNN家族成员，能够促进成纤维细胞增殖、细胞外基质产生及组织肉芽组织形成及不同类型的细胞粘附聚集和胶原收缩。而有研究发现在CTGF存在条件下， TGFβ1在极低浓度时也能与其受体结合，说明CTGF能加强TGFβ1与其受体结合，引起TGFβ1/Smad通路介导的靶基因转录活化，促使纤维化发生。因此PPARγ配体抑制TGFβ1促纤维化效应可能部分是通过抑制CTGF基因表达实现的。
　　 TGFβ1/Smad信号通路在细胞内发挥作用，需要TGFβ1受体激活的Smad2/3形成复合物转移到细胞核结合活化因子结合CBP/P300，再与靶基因SBE序列，调节靶基因表达。人肺成纤维细胞中Smad3促进TGFβ1诱导胶原收缩，且在TGFβ1诱导基因表达中起重要作用。且有研究发现博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，敲除Smad3基因可缓解肺纤维化程度，说明Smad3在TGFβ1/Smad信号通路中起重要作用。Smad3蛋白可以在通路中发生磷酸化、乙酰化及泛素化等蛋白修饰，那么PPARγ配体抑制TGFβ1通路效应可能与Smad3蛋白有密切关系。肺成纤维细胞系(A549)中PPARγ配体罗格列酮对TGFβ1诱导的Smad2/3的磷酸化水平变化没有影响。而我们发现肺成纤维细胞中加入TGFβ1后，随着时间延长乙酰化Smad3蛋白表达增加。而蛋白的乙酰化与基因的活跃表达有关，蛋白发生乙酰化后，发生染色质构型重建，染色质处于相对松弛状态，使蛋白易于与活化因子或其他蛋白相互作用，利于靶基因转录调控。蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制之一，而这种修饰作用分别由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)调控，所以HAT/HDAC间接调节基因的转录和沉默，而HAT/HDAC平衡的紊乱会使基因表达失控，导致组织纤维化发生。Smad3蛋白乙酰化需要HAT作用，根据HAT在细胞内分布及诱导乙酰化后的效应分为A型HAT(核内)和B型HAT(胞质)两类，其中A型HAT中的p300是TGFβ1/Smad通路调节靶基因转录所必须的，且TGFβ1/Smad通路与PPARγ通路在细胞内共用活化因子P300，因此可能存在竞争抑制。正如腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制TGFβ1诱导胶原产生及α-SMA表达是通过与Smad3竞争结合P300。而P300是腺病毒EIA相关的核磷蛋白，具有固定结构，含有组蛋白乙酰化转移酶区域(HAT)，能使Smad3的MH2区K378位点发生乙酰化。且TGFβ1调节smad2/3乙酰化并促进Smad3与P300结合在其他细胞系中也有被证实。本次实验中，我们发现，在人肺成纤维细胞中加入TGFβ1能促使Smad3与P300的结合增多，而加入PPARγ配体罗格列酮后，Smad3与P300结合减少。由于PPARγ通路也需要结合P300，单独加入配体后，PPARγ与P300结合相对增加，所以PPARγ配体发挥抗纤维化可能通过与Smad3竞争结合P300，使得Smad3/P300复合物形成减少有关，进而减少靶基因转录。在皮肤成纤维细胞中也存在PPARγ配体通过作用转录活化因子P300消弱Smad依赖的胶原合成，使得TGFβ1诱导的转录效应减弱。另外，PPARγ配体抑制效应也可能通过干扰Smad2/3/4复合物在细胞核内聚集或阻断Smad复合物与SBE序列启动子结合，阻断转录过程，而这一原因有待证实。
　　 综上所述，CTD-ILD患者肺组织中PPARγ的表达量降低，体外实验发现PPARγ配体能够显著抑制TGFβ1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，这一作用可能是通过与Smad3竞争性结合P300来实现的。因此，PPARγ配体活化的PPARγ通路有望成为治疗结缔组织病相关的间质性肺疾病的新靶点。
　　 结论：
　　 1.PPARγ在CTD-ILD中表达降低，不能发挥抗炎、抗纤维化作用，间接导致肺纤维化发生发展。
　　 2.罗格列酮具有抗纤维化效应，且是依赖PPARγ实现的。
　　 3.PPRγ抗肺纤维化效应机制之一是通过与Smad3竞争性结合P300来实现的。

目录

摘要

前言

材料方法

一 主要试剂配置、器材及仪器设备

1．1 试剂

1．2 器材

1．3 主要仪器设备

1．4 主要试剂配置

二 实验方法

2．1 免疫组织化学方法检测PPARγ在CTD-ILD患者和正常肺组织中的表达

2．2 人肺成纤维细胞的分离和鉴定

2．3 TGFβ1对人肺成纤维细胞分化及罗格列酮对TGFβ1诱导分化的影响

2．4 罗格列酮对TGFβ1诱导分化的影响

2．5 免疫共沉淀-免疫印迹(WB-IP)检测

三 统计学分析

结果

一 PPARγ在肺组织中的表达

二 TGFβ1促进人肺成纤维细胞中α-SMA表达

三 MTT法检测罗格列酮对人肺成纤维细胞活性的影响

四 罗格列酮能够抑制TGFβ1诱导人肺成纤维细胞中α-SMA表达

五 PPARγ拮抗剂GW9662能抵消罗格列酮的抑制效应

六 RT-PCR检测PPARγ配体对Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子(CTGF)的影响

七 TGFβ1增加肺成纤维细胞Smad3乙酰化水平

八 罗格列酮对smad3与P300结合的影响

讨论

一 TGFβ1的促纤维化效应

二 PPARγ的抗纤维化效应

三 PPAR抑制肺纤维化的可能机制

四 本研究的局限与展望

结论

参考文献

缩略语

致谢

声明

统计学审核证明