MRP8和MRP14介导人脐静脉内皮细胞通透性改变的功能研究

摘要

髓样相关蛋白8（MRP8，又叫做S100A8或Calgranulin A）和髓样相关蛋白14（MRP14，又叫做S100A9或Calgranulin B）是两种钙离子结合蛋白，属于钙结合S100蛋白家族。并且MRP8和MRP14通常以MRP8/14复合物的形式存在。MRP8/14复合物占中性粒细胞胞浆总蛋白的40％，中性粒细胞激活后MRP8、MRP14和MRP8/14被特异性释放，在骨髓分化、炎症过程中发挥作用，并表现出抗菌活性。
　　 血管内皮细胞是一层半选择通透性屏障。研究表明血管内皮通透性增高涉及炎症、烧伤、休克、免疫、肿瘤转移等一系列病理过程的发生和发展，是全身炎症反应发生发展的关键因素，甚至是晚期休克患者死亡的主要原因之一。对内皮细胞而言，MRP8和MRP14显著增加了白细胞与内皮细胞的粘附，并且能够在体外诱导人微血管内皮细胞发生炎症反应。而最近有研究发现，MRP8/14(200μg/ml)刺激皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)6 h后能够导致与内皮细胞完整性相关的多种基因下调，比如α-catenin，cadherin等;而另有文献报道，MRP8和MRP14作为Toll样受体4(TLR4)的内源性配体，显著加剧了内毒素导致的休克。我们推测MRP8、MRP14在短时间内就会导致内皮细胞通透性增加。
　　 MRP8和MRP14通过何种方式作用于内皮细胞尚有争论。现在，人们越来越多的认为，细胞外MRP8和MRP14通过细胞膜表面的模式识别受体——比如TLR4和RAGE来发挥其功能。而在内皮细胞TLR4和RAGE都有表达，因此，本研究将从受体的角度，探讨MRP8、MRP14、MRP8/14是否是通过TLR4和（或）RAGE导致内皮细胞通透性的变化。
　　 丝裂原活化蛋白激酶（MRPKs）是一组丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，并且MAPKs几乎表达于所有的细胞类型。MAPKs是细胞信号转导过程的重要组成元件，并且对调节基因表达、有丝分裂、代谢、凋亡、增殖、分化等具有重要的作用。而有证据表明MRP8/14能够激活JNK、p38和ERK1/2信号通路。因此在本研究中我们还将探讨MAPKs是否参与了MRP8、MRP14和MRP8/14介导的内皮细胞通透性增加。
　　 目的:
　　 本研究以脐静脉内皮细胞(HUVECs)为靶点，探讨MRP8、MRP14和MRP8/14能否介导HUVECs通透性增高，并且从受体和信号转导通路的角度讨论MRP8、MRP14和MRP8/14是否通过作用于TLR4和(或)RAGE激活MAPKs通路引起通透性增高，从而进一步阐明MRP8、MRP14和MRP8/14介导内皮细胞通透性增高的机制。
　　 方法:
　　 本研究以HUVECs为研究对象，采用细胞培养、跨内皮细胞电阻(TER)测定、免疫印记、免疫荧光等方法，观察MRP8、MRP14和MRP8/14对单层HUVECs TER的影响以及MRP8、MRP14和MRP8/14刺激之后F-actin和ZO-1形态学的变化，从而确定MRPs能否破坏HUVECs的屏障功能，引起HUVECs通透性增高;另外检测MRP8、MRP14和MRP8/14对p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平的影响，并且采用p38特异性抑制剂SB203580、ERK1/2特异性抑制剂PD98059和JNK特异性抑制剂SP600125干预，观察干预因素对MRPs介导HUVECs通透性增高的影响，从而证明MRPs是否通过MAPKs通路介导HUVECs通透性增高;同时，采用TLR4特异性抑制剂TAK242和anti-RAGE抗体干预，观察封闭TLR4和RAGE之后，对MRPs介导HUVECs通透性增高以及MRPs介导MAPKs磷酸化水平增高的影响，从而阐明MRPs是否通过TLR4和（或）RAGE介导HUVECs通透性增高;除此之外，我们还应用无Ca2+液体（PBS或应用EGTA螯合Ca2+）处理细胞，观察Ca2+在MRPs介导HUVECs通透性增高中的作用，从而证明MRPs是否以Ca2+依赖性的方式介导HUVECs通透性增高。
　　 结果:
　　 1.MRPs以时间依赖和剂量依赖的方式介导HUVECs通透性增高
　　 (1)浓度梯度的MRP8（0、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml）、MRP14(0、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml)和MRP8/14（0、0.5、1.0、2.0和4.0μg/ml）分别刺激单层HUVECs120 min，MRP8不同浓度之间有显著性差异(F=79.604，P=0.000)，不同时间之间也有显著性差异(F=114.348，P=0.000)，浓度和时间之间存在交互效应（F=34.266，P=0.000）。在相同的时间点，MRP8以浓度依赖的方式引起HUVECs通透性增高，并且在0-30 min内，各浓度的MRP8都能以时间依赖性的方式引起HUVECs通透性增高。而在30 min后，MRP8介导的HUVECs通透性增高进入一个相对稳定的平台期。与MRP8相似，MRP14和MRP8/14都能以时间依赖和浓度依赖的方式介导HUVECs通透性增高。MRP14和MRP8/14不同浓度之间均有显著性差异（F值分别为47.864和52.972，P值均为0.000），不同时间之间也均有显著性差异（F值分别为112.496和158.498，P值均为0.000），浓度和时间之间存在交互效应(F值分别为12.890和12.554，P值均为0.000)。但是与MRP8的作用方式不同，在加入刺激后0-120min内，MRP14和MRP8/14介导的HUVECs通透性增高在时间上是逐渐增高的，并没有平台期的出现。
　　 (2)在形态学上，MRP8（2.0μg/ml）刺激10min后，可见F-actin和ZO-1形成的致密带被破坏，细胞内F-actin形成明显的应力纤维，ZO-1分布不连续，呈现锯齿状裂隙。与MRP8刺激相似，MRP14和MRP8/14刺激之后，都可见F-actin应力纤维的形成和ZO-1的破坏。这些结果为MRP8、MRP14和MRP8/14介导HUVECs通透性增高提供了形态学上的证据。
　　 2.MRPs通过p38和ERK1/2信号转导通路介导HUVECs通透性增高
　　 (1) MRP8（2.0μg/ml）分别刺激HUVECs0、10、30、60和120 min之后，各组之间p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均有显著性差异（F值分别为4.930、8.252和6.357;P值分别0.019、0.003和0.008）。MRP8（2.0μg/ml）刺激HUVECs10 min后，与正常对照组相比p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平都显著性增高，并且当MRP8作用时间延长至30、60和120 min，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平的增高均在30-60 min时达到峰值，而120 min时有所下降。同样，MRP14和MRP8/14也能导致MAPKs磷酸化水平增高。MRP14刺激HUVECs之后，各组之间p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均有显著性差异（F值分别为7.882、12.974和7.506;P值分别0.004、0.001和0.005）;MRP8/14刺激HUVECs之后，各组之间p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平也均有显著性差异（F值分别为9.186、5.957和4.290;P值分别0.002、0.010和0.028）。并且MRP14和MRP8/14作用10 min后，p38和ERK1/2磷酸化水平与正常对照组相比显著性增高，而JNK磷酸化水平虽然有所增高但与正常对照组相比却无显著性差异。而MRP14和MRP8/14作用30min，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平与正常对照组相比都显著性增高。
　　 (2)分别采用p38、ERK1/2和JNK的特异性抑制剂SB203580、PD98059和SP600125预处理HUVECs60 min后，再给予MRP8、MRP14和MRP8/14刺激120 min，然后测量TER。结果发现，不管是MRP8、MRP14还是MRP8/14作为刺激物，不同分组之间均有显著性差异(F值分别为83.647、85.645和137.528;P值均为0.000)，不同时间之间也均存在显著性差异（F值分别为399.476、260.949和987.621;P值均为0.000），分组因素和时间因素之间存在交互效应（F值分别为31.689、18.633和80.156;P值均为0.000）。并且SB203580和PD98059能显著抑制MRP8、MRP14和MRP8/14引起的HUVECs通透性增加。而SP600125对MRP8、MRP14和MRP8/14介导的通透性增高无影响。这提示:MRP8、MRP14和MRP8/14通过p38和ERK1/2信号通路介导HUVECs通透性增高。
　　 (3)在形态学上，p38抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059能显著抑制应力纤维的形成和ZO-1的破坏。而JNK抑制剂SP600125对MRP8、MRP14和MRP8/14介导的应力纤维形成、ZO-1破坏没有抑制作用。以上结果在形态学上进一步证明了MRP8、MRP14和MRP8/14通过p38和ERK1/2信号通路破坏HUVECs屏障功能。
　　 3.MRP8通过TLR4、MRP14通过RAGE介导HUVECs通透性增高
　　 (1)分别用TLR4特异性抑制剂TAK242抑制TLR4、anti-RAGE抗体封闭RAGE，然后给予MRP8（2.0μg/ml）、MRP14（2.0μg/ml）和MRP8/14（2.0μg/ml）刺激HUVECs120 min，分别于0、60和120min测量TER。结果显示:不管是MRP8、MRP14还是MRP8/14作为刺激物，不同分组之间均存在显著性差异(F值分别为126.431、74.816和30.440;P值均为0.000)，不同时间之间也有显著性差异（F值分别为355.094、356.445和186.168;P值均为0.000），分组因素和时间因素之间存在交互效应(F值分别为51.834、45.956和17.810;P值均为0.000)。并且TAK242显著抑制了MRP8介导的HUVECs通透性增高，而anti-RAGE对MRP8介导的HUVECs通透性增高无影响;对于MRP14而言，anti-RAGE而非TAK242显著抑制了其介导的HUVECs通透性增高;而TAK242和anti-RAGE都可以抑制MRP8/14介导的通透性增高，并且当两种抑制剂合用时，其抑制效果更加显著。
　　 (2)利用Western Blot检测TAK242和anti-RAGE对MRP8、MRP14和MRP8/14介导p38和ERK1/2磷酸化水平增高的影响。结果显示:当MRP8刺激HUVECs时，各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异（F值分别为49.885和86.672，P值均为0.000），TAK242而非anti-RAGE显著抑制了MRP8介导的p38和ERK1/2磷酸化水平增高;当MRP14刺激HUVECs时，各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异（F值分别为11.023和8.402，P值均为0.000），并且与MRP8刺激不同，anti-RAGE而非TAK242显著抑制了MRP14介导的p38和ERK1/2磷酸化水平增高;当MRP8/14刺激HUVECs时，各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异（F值分别为60.005和46.784，P值均为0.000），而TAK242和anti-RAGE都能抑制MRP8/14介导的p38和ERK1/2磷酸化水平增高，并且当两种抑制剂合用时，其抑制效果更加显著。
　　 以上结果提示:MRP8通过TLR4、MRP14通过RAGE激活p38和ERK1/2信号通路从而介导HUVECs通透性增高;而MRP8/14既可以通过TLR4又可以通过RAGE介导HUVECs通透性增高。
　　 4.MRPs介导HUVECs通透性增高是Ca2+依赖性的
　　 (1)在有或者无MRP8(2.0μg/ml)的情况下，HUVECs在无Ca2+环境(PBS)中孵育30 min，然后加入1.3 mM的Ca2+，继续作用60 min，测量TER。结果显示，各组之间存在显著性差异（F=136.026，P=0.000），不同时间之间也有显著性差异(F=187.980，P=0.000)，而分组因素和时间因素之间存在交互效应（F=101.373，P=0.000）。在无Ca2+条件下不管是否有MRP8刺激，与正常对照组相比，HUVECs通透性都升高，但PBS组与“PBS+MRP8”组相比无显著性差异;当加入1.3 mM的Ca2+后，PBS组通透性逐渐恢复，“PBS+MRP8”组HUVECs的通透性非但没有恢复，反而继续升高，与PBS组相比有显著性差异。这些结果表明:在没有Ca2+时，MRP8不能导致HUVECs通透性增加，而在正常Ca2+浓度下，MRP8才能导致HUVECs通透性增高，即MRP8介导的HUVECs通透性增加是Ca2+依赖性的。为了进一步证明MRP8介导HUVECs通透性增加是Ca2+依赖性的，我们先用无Ca2+液体(PBS)处理HUVECs30min，然后用经过浓度梯度Ca2+（0、0.25a、0.5a和a，a=0.37μM，为刚好饱和2.0μg/ml MRP8钙离子结合位点的Ca2+浓度）孵育的MRP8(2.0μg/ml)刺激60 min。结果发现，不同组之间存在显著性差异（F=405.592，P=0.000），不同时间之间也有显著性差异（F=1647.036，P=0.000），而分组因素和时间因素之间存在交互效应(F=128.156，P=0.000)。在相同浓度MRP8、不同浓度Ca2+刺激下，HUVECs通透性呈Ca2+浓度依赖性的增加。这进一步说明，MRP8介导的HUVECs通透性增加是Ca2+依赖性的。采用相同的方法，我们发现MRP14介导的HUVECs通透性增加也是Ca2+依赖性的。
　　 (2)另外，我们分别在正常Ca2+浓度和无Ca2+环境中利用MRP8(2.0μg/ml)和MRP14(2.0μg/ml)刺激HUVECs120 min，western blotting检测p38和ERK1/2磷酸化水平的变化，结果发现:各组之间p38和ERK1/2磷酸化水平均存在显著性差异（F值分别为47.041和234.488，P值均为0.000），并且在无Ca2+条件下MRP8和MRP14都不能引起p38和ERK1/2磷酸化水平的增高;而在正常Ca2+下，MRP8和MRP14能够引起p38和ERK1/2磷酸化水平显著性增高。
　　 以上结果提示:MRP8和MRP14都以Ca2+依赖性的方式激活p38和ERK1/2信号通路，从而导致HUVECs通透性增高。
　　 结论:
　　 1.MRP8、MRP14和MRP8/14都能够以时间依赖和剂量依赖的方式介导HUVECs通透性增高;
　　 2.MRP8、MRP14和MRP8/14通过激活p38和ERK1/2信号通路介导HUVECs通透性增高;
　　 3.MRP8主要通过TLR4、MRP14主要通过RAGE介导HUVECs通透性增高，而MRP8/14既可以通过TLR4又可以通过RAGE介导通透性增高;
　　 4.MRP8和MRP14介导的HUVECs通透性增高都是Ca2+依赖性的。

目录

摘要

前言

材料与方法

一、主要试剂与材料

二、主要仪器设备

三、主要试剂配制

四、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

英文缩略词

致谢

声明

统计学证明