慢病毒介导VEGF165基因修饰的嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究

摘要

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)在世界范围内均被认为是主要的公共健康问题，常导致患者严重的神经功能损害。SCI后，由于炎症反应，空洞形成，髓磷脂相关抑制剂以及胶质瘢痕的形成均造成轴突再生困难，而且脊髓的内源性前体细胞分化为成熟的胶质细胞能力有效。因此，使用外源细胞移植治疗SCI，成为目前研究的热点之一。
　　 嗅鞘细胞(Olfactory Ensheathing cells，OECs)，以及嗅神经成纤维细胞，共同构成嗅神经的包被部分。OECs伴随嗅神经纤维从鼻腔嗅粘膜直至嗅球神经层。动物实验表明，OECs移植治疗有助于SCI后轴突的更新和功能学恢复。而且，OECs也可以作为基因的载体治疗SCI。
　　 血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)，最早发现于1983年，当初被命名为肿瘤分泌的血管渗透因子，后在1989年得到纯化，并命名为VEGF。VEGF是一种分泌性丝裂原，可与其酪氨酸激酶受体结合，具有促进血管生成的作用。研究表明，VEGF同样可以促进神经形成，有助于对神经元和神经胶质细胞的保护，刺激轴突生长以及抑制凋亡。动物实验表明，使用VEGF蛋白或者外源性VEGF基因转染，均可以促进轴突更新，减轻二次损伤以及促进神经功能恢复。
　　 目前嗅鞘细胞与VEGF联合治疗脊髓损伤未见报导。本研究中，我们使用表达VEGF基因的嗅鞘细胞治疗脊髓损伤。该研究将是治疗脊髓损伤一次非常有价值的尝试。
　　 第一部分 OECs的分离、培养和鉴定
　　 目的:体外分离、培养，鉴定OECs。
　　 方法:采用差速贴壁法和免疫抑制剂法，从乳鼠嗅球中获得OECs。观察其一般形态，并行免疫荧光鉴定。
　　 结果:光镜观察见细胞具备典型的OECs形态学特征。免疫荧光结果显示:OECs阳性表达GFAP，p75NFGR，细胞纯度大于90％。
　　 结论:分离培养出OECs，形态学和免疫表型符合OECs标准
　　 第二部分慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-VEGF165的构建及包装，分泌VEGF的OECs建立。
　　 目的:构建表达VEGF的慢病毒载体，并进行包装、鉴定、纯化及滴度测定。观察慢病毒感染OECs的效率，检测目的基因的表达。
　　 方法:通过PCR获得VEGF165基因，酶切后鉴定。再通过双酶切后的连接反应，构建出慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-VEGF165。pLVX-IRES-Neo-VEGF165转染HEK293细胞。病毒液用氯化铯法进行纯化，倍比稀释法测病毒滴度。使用不同感染复数(MOI)感染OECs，荧光显微镜观察转染效率。RT-PCR检测VEGF基因表达。VEGF相对表达水平比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间的多重比较采用LSD检验。western bolt法检测VEGF蛋白表达。数据采用均数±标准差（(X)±SD）表示。统计学分析采用SPSS13.0软件，P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:测序证明，慢病毒载体pLVX-IRES-Neo-VEGF165成功构建，倍比稀释法检测病毒滴度达到108 pfu/mL。RT-PCR和western bolt法证实OECs-VEGF表达VEGF基因和蛋白。
　　 结论:利用PCR方法成功获取了目的基因VEGF165。成功构建了重组慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo-VEGF165，并在HEK293细胞完成包装。感染后的OECs可表达VEGF基因和蛋白。
　　 第三部分慢病毒介导VEGF165基因修饰的嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤
　　 目的:以慢病毒介导的VEGF165基因修饰的嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓半横断损伤，观察其疗效。
　　 方法:构建大鼠脊髓半横断损伤模型。动物随机分为:PBS移植组，OECs移植组，OECs-VEGF移植组。
　　 损伤7天后，分别将PBS，OECs以及OECs-VEGF移植于脊髓损伤处。细胞组在移植前，行Hoechst33342标记。在SCI前及损伤后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w进行BBB评分评价运动功能恢复情况。移植后7天，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay ELISA)法检测各组体内VEGF蛋白表达。移植后5w，免疫荧光法检测移植细胞在体内的存活、5-HT神经纤维数量，HE染色方法检测脊髓空洞体积，westerbolt法检测体内凋亡相关蛋白表达。
　　 体内VEGF蛋白水平，5-HT神经纤维数量，脊髓空洞体积检测结果比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间多重比较采用LSD法。各个时间点的BBB评分比较，采用重复测量方差分析(repeat measureANOVA)，组间多重比较采用LSD法。数据采用均数±标准差（(X)±SD）。用统计学软件SPSS13.0对数据进行处理，以P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果:SCI后1周以内，各组BBB评分无统计学差异，第2周至第6周，OECs-VEGF组与PBS组相比，BBB评分出现统计学差异(P＜0.01);第3周至第6周，OECs组与PBS组比较，BBB评分有统计学差异(P＜0.01);第3周至第6周，OECs组和OECs-VEGF组相比，BBB评分有统计学差异(P＜0.01)。细胞移植后1周脊髓组织中VEGF含量，PBS组:5.34±1.66pg/mg，OECs组:11.36±1.46 pg/mg，OECs-VEGF组:108.87±22.33 pg/mg。三组间均存在显著差异(P＜0.001)。LSD法行组问比较发现，OECs-VEGF组VEGF蛋白水平显著高于另两组的VEGF蛋白水平。5-HT神经纤维数量，PBS组:8.71±0.35％; OECs组:17.43±0.66％; OECs-VEGF组:28.50±0.63％;F组问=275.474; P=0.0001三组间均存在显著差异(P＜0.05)。LSD法行组间比较发现，OECs-VEGF组VEGF蛋白水平显著高于另两组的VEGF蛋白水平(P＜0.05)。HE染色检测脊髓空洞体积，PBS组:18.18±0.39; OECs组:13.98±0.66; OECs-VEGF组:9.41±0.61;F组问=224.454; P=0.0001三组间均存在显著差异(P＜0.05)。LSD法行组间比较发现，OECs-VEGF组脊髓空洞体积百分比显著低于另两组的脊髓空洞体积百分比(P＜0.05)。Western blot检测了凋亡相关蛋白，OECs-VEGF组与PBS组，OECs组相比，caspase-3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高。
　　 结论:以OECs-VEGF基因工程细胞移植治疗SCI，显著提高了脊髓组织内VEGF的表达量，减少脊髓空洞体积百分比，促进了SCI后大鼠的功能学恢复。其机制包括:表达VEGF的OEC基因工程细胞，促进神经轴突的存活，抑制细胞凋亡。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 嗅鞘细胞的体外培养和鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

第二部分 表达VEGF165基因的慢病毒载体的构建和鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三部分 慢病毒介导VEGF165基因修饰的嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文情况

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致谢

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统计学证明