miR-150再表达通过靶向c-Myb诱导EBV阳性Burkitt淋巴瘤分化

摘要

背景：
　　 Burkitt淋巴瘤是一种高度侵袭性B细胞性淋巴瘤，根据发病区域及临床表现可分为三种类型:地方性、散发性和免疫缺陷相关性;根据EB病毒感染情况还可分为EBV阳性和EBV阴性Burkitt淋巴瘤。至于Burkitt淋巴瘤的起源，有研究报道，EBV阳性的肿瘤细胞可能起源于中心母细胞，而EBV阴性的肿瘤细胞可能起源于后中心细胞或记忆B细胞。近年来，虽然在肿瘤治疗方面做了许多努力，如抑制肿瘤细胞快速增殖及高强度短期的联合化疗，但还是会有明显的副作用，如细胞毒性和肿瘤溶解综合征。因此，迫切需要寻找更有效的治疗方法。
　　 肿瘤细胞的发生是正常细胞在各种内外环境因素影响下细胞分化发生紊乱的结果，而细胞分化紊乱是一个多基因、多步骤的过程，单独改变某种基因的表达很难对细胞分化产生实质性的影响。miRNAs(miRNAs)是一类普遍存在于动植物中的长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，迄今为止，大约有2000多种miRNAs被发现鉴定，它们参与细胞增殖、分化、凋亡、和胚胎发育等一系列重要的生命过程。一种miRNA可以调控数百种靶基因，而且它所调控的基因中相当一部分是转录因子，后者本身就扮演一个调控者的角色。因此，改变一种miRNA的表达就会对细胞产生剧烈的效应。种种研究迹象表明，miRNAs具有强烈的调控细胞分化的作用，调整其表达能诱导肿瘤细胞向正常细胞分化，很有可能成为诱导分化治疗的新型诱导分化剂。
　　 诱导分化治疗又称为肿瘤细胞的再分化(redifferentiation)，是在某些诱导分化剂的作用下诱导肿瘤细胞向正常细胞方向分化，改变肿瘤细胞的增殖、浸润、侵袭、转移等恶性特征，达到治疗肿瘤的目的。诱导分化将会成为肿瘤治疗的一个新的发展方向。值得一提的是，淋巴造血系统肿瘤是研究诱导分化的较好的模式肿瘤，因为该系统肿瘤的发生是由于淋巴造血细胞分化紊乱或分化阻滞的结果，在淋巴造血细胞发育分化的不同阶段都可以产生相对应类型的肿瘤，不同分化阶段的淋巴造血细胞都有其特定的免疫表型及基因特征，便于鉴别和检测。
　　 在淋巴造血细胞发生过程中，miRNAs的动态表达模式提示其在决定造血细胞分化过程中发挥重要的作用，其中最引人注目的是miR-150，该基因位于19q13.33，成熟的miR-150由22个核酸组成，它随着B细胞发育的成熟表达量逐步升高，是B淋巴细胞分化的关键因子。有研究发现，与正常B细胞相比，不同亚类的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)肿瘤细胞miR-150普遍低表达。同时也有研究发现，与正常NK/T细胞相比，在NK/T细胞淋巴瘤细胞株和临床标本中，miR-150低表达或表达缺失。然而在不同类型的淋巴瘤细胞miR-150表达情况怎样？在Burkitt淋巴瘤细胞中纠正miR-150的表达后，能否诱导细胞向成熟浆细胞方向分化了？
　　 新近研究表明，在老鼠动物模型内，miR-150通过负性调节c-Myb表达来控制pro-B向pre-B细胞分化。c-myb是一种原癌基因，编码核DNA结合蛋白，行使转录活化和抑制功能。随着造血细胞的成熟分化，其表达逐渐下降，与miR-150的表达模式刚好相反。那么在人类Burkitt淋巴瘤中，miR-150和c-Myb的关系又如何了？需要进一步探究。
　　 目的：
　　 1.观测hsa-miR-150和c-Myb在人类正常不同分化阶段B淋巴细胞和不同淋巴瘤细胞系表达谱。
　　 2.构建Burkitt淋巴瘤细胞株稳定表达hsa miR150细胞亚系Raji-miR-150, Daudi-miR150, Ramos-miR-150和口BJAB miR-150。
　　 3.探究miR-150再表达诱导Burkitt淋巴瘤细胞向末端浆细胞方向分化的可能性及其机制。
　　 方法：
　　 1.hsa-miR-150和c-Myb在人类正常不同分化阶段B淋巴细胞亚群和不同淋巴瘤细胞系表达模式采用流式细胞技术从扁桃体炎患者中的扁桃体内分选出不同分化阶段B淋巴细胞群，包括nai)ve细胞，中心母细胞，中心细胞和记忆B细胞;运用real-time PCR检测hsa-miR-150和c-Myb在正常不同分化阶段B淋巴细胞群和各株淋巴瘤细胞中的表达水平;利用Western Blot在蛋白水平检测正常B细胞各株淋巴瘤细胞c-Myb的表达水平。
　　 2.稳定表达hsa-miR-150的Burkitt淋巴瘤细胞亚系Raji-miR-150，Daudi-miR-150，Ramos-miR-150和BJAB-miR-150的构建及其生物学特性含目的基因(hsa-miR-150)的慢病毒表达载体购自上海吉凯公司;将含有重组慢病毒质粒（实验组，对照组）的病毒上清分别转染Burkitt淋巴瘤细胞亚系Raji，Daudi，Ramos和BJAB细胞系，并命名为Raji-miR-150，Daudi-miR-150，Ramos-miR150和BJAB-miR150细胞，实验组和对照组均带有GFP标签，对照组分别命名为Raji-GFP，Daudi-GFP，Ramos-GFP和BJAB-GFP细胞。利用流式细胞技术根据GFP的表达筛选出阳性细胞。对新构建的细胞亚系，通过real-time PCR检测实验组和对照组miR-150的表达;流式细胞技术检测细胞增殖和凋亡，MTT法检测细胞增殖。
　　 3.hsa-miR-150再表达可诱导EBV阳性的Burkitt淋巴瘤再分化通过流式细胞技术检测生发中心标记物CD10，B细胞标记物CD19及浆细胞标记物CD38和CD138在各细胞亚系实验组和对照组中的表达情况，并检测与细胞大小及细胞内细胞器多少相关的流式物理参数FS和SS的情况。
　　 运用real-time PCR，Western Blot和免疫共聚焦检测各细胞亚系实验组和对照组中与B细胞分化相关基因BCL6，PRDM1及bcl-2的表达。
　　 4.hsa-miR-150再表达通过调整c-Myb的表达发挥作用运用real-time PCR，Western Blot和免疫共聚焦检测各细胞亚系实验组和对照组中c-Myb的表达。在Raji和Daudi细胞中干扰c-Myb的表达，再通过real-time PCR和Western Blot检测与B细胞分化相关基因BCL-6，PRDM1及bcl-2的表达。在Daudi-miR-150及Raji-miR-150中抑制miR-150的表达，运用Western Blot检测c-Myb的表达。
　　 5.初步探讨在Burkitt淋巴瘤中hsa-miR-150表达紊乱的机制运用real-time PCR和Western Blot检测Burkitt淋巴瘤Raji和Daudi及相应各细胞亚系实验组和对照组中c-Myc的表达。在Daudi细胞中抑制c-Myc的表达后检测miR-150的表达。
　　 统计学处理
　　 采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差（(x)±SD）表示。Real-time PCR结果用单向方差分析(one-wayANOVA)，流式检测结果、MTT分析结果用两独立样本t检验。按P＜0.05，差异具有统计学意义，P＜0.01具有显著性差异。
　　 结果：
　　 1.hsa-miR-150和c-Myb在人类正常不同分化阶段B淋巴细胞群和不同淋巴瘤细胞系表达模式(1)人扁桃体不同分化阶段B淋巴细胞群的分选根据以下免疫表型分选相应细胞群:B细胞(CD19+)，Na(i)ve B细胞(CD19+，IgD+，CD38-)，中心母细胞(CD19+，IgD-，CD38+，CD77+)，中心细胞(CD19+，IgD-，CD38+，CD77-)，及记忆B细胞(CD19+，IgD-，CD38-)。
　　 (2) hsa-miR-150和c-Myb在正常不同分化阶段B淋巴细胞群中的表达real-time PCR结果显示，miR-150和c Myb的表达在不同分化阶段呈现动态性的变化，二者在四群细胞中的表达模式基本互补，即miR-150在Na(i)veB细胞和记忆B细胞中高表达，而在中心母细胞和中心细胞中低表达;c-Myb在Na(i)ve B细胞和记忆B细胞中低表达，而在中心母细胞和中心细胞中高表达。
　　 (3) hsa-miR-150和c-Myb在不同淋巴瘤细胞系表达real-time PCR结果显示，与正常成熟的B细胞相比，miR-150在各株淋巴瘤细胞株中包括Raji，Daudi，Ramos，BJAB，KM3，KARPAS-299，Jurkat及L428均低表达，而c-Myb均普遍高表达;Western Blot进一步显示c-Myb在这些淋巴瘤细胞株中高表达。
　　 2.稳定表达hsa-miR-150的Burkitt淋巴瘤细胞亚系Raji-miR-150，Daudi-miR-150，Ramos-miR-150和BJAB-miR-150的构建及其生物学特性(1)表达hsa-miR-150慢病毒的设计和病毒颗粒的合成本实验运用了表达hsa-miR-150慢病毒载体(PP-GFP)及对照组慢病毒空载体（只带GFP），启动子均为CMV。载体的设计由上海吉凯生物公司承担。
　　 (2)稳定表达hsa-miR-150细胞亚系的构建将载有hsa-miR-150的慢病毒载体转染Burkitt淋巴瘤细胞株Raji，Daudi，Ramos和BJAB细胞株，同时将空载体转染这些细胞。运用流式细胞技术筛选出GFP+的细胞，real-time PCR检测转染效率，结果显示，转染后，实验组miR-150的表达与正常中心母细胞相近，而对照组变化不大。
　　 (3)各细胞亚系增殖和凋亡的观测流式细胞技术检测Raji-miR-150，Daudi-miR-150，Ramos-miR-150和BJAB-miR-150与对照组Raji GFP，Daudi-GFP，Ramos-GFP和BJAB-GFP的增殖和凋亡情况;MTT进一步检测了Raji-miR-150，Daudi-miR-150及其对照组的增殖情况。结果显示，与对照组相比，Daudi-miR-150和Raji-miR150的增殖显著减慢，而其余各组没有明显变化;与对照组相比，Daudi-miR-150的凋亡显著增加，而其余各组没有明显变化。
　　 3.hsa-miR-150再表达诱导EBV阳性的Burkitt淋巴瘤向浆细胞方向分化(1)各细胞亚系与B细胞分化相关指标的观测real-time PCR和Western Blot检测了BCL6，PRDM1及bcl-2在各细胞亚系中的表达，结果显示，与对照组相比，BCL6在Raji-miR-150和Daudi-miR-150中表达明显降低，而PRDM1及bcl-2在Raji-miR-150和Daudi-miR-150中表达明显增强;三者在Ramos-miR-150及BJAB-miR-150中的表达没有明显变化。免疫共聚焦在Raji-miR-150细胞中进一步验证了上述结果。
　　 (2)各细胞亚系表面标记物的观测流式细胞技术检测了CD19，CD10，CD38及CD138的表达，结果显示，与对照组相比，在Raji-miR-150中CD10的表达明显减弱，CD38的表达明显增强，具有统计学意义(t=-160.66，P＜0.001;t=-51.19，P＜0.001);在Daudi-miR-150中，CD19和CD10的表达明显减弱（t=-350.67，P＜0.001），并出现了CD138的表达(t=-186.75，P＜0.001)，结果具有统计学意义;而在Ramos-miR-150及BJAB-miR-150中，与对照组相比，这些表面标记物没有明显变化。
　　 (3)各细胞亚系细胞大小和细胞内细胞器的观测利用流式细胞技术检测了与细胞大小和细胞内细胞器多少有关的物理参数FS及SS，结果显示，与对照组相比，Raji-miR-150细胞明显增大且细胞内细胞器明显增多(t=65.57，p＜0.001)，在Daudi-miR-150中，细胞内细胞器也明显增多(t=86.77; p＜0.001)，结果具有统计学意义。
　　 4.hsa-miR-150再表达通过调整c-Myb的表达发挥作用(1) c-Myb在各细胞亚系中的表达情况real-time PCR和Western Blot检测了 c-Myb在各细胞亚系中的表达，结果显示，与对照组相比，尽管在蛋白水平上，c-Myb的表达在Raji-miR-150及Daudi-miR-150均降低，但在mRNA水平上，c-Myb的表达分别是降低及没有明显变化。运用荧光共聚焦实验在Raji-miR-150细胞中进一步得到了验证。
　　 (2)在Daudi-miR-150及Raji-miR-150中抑制miR-150的表达后c-Myb的表达检测在Daudi-miR-150及Raji-miR-150中通过竞争性抑制剂抑制miR-150的表达后，利用Western Blot在蛋白水平上检测了c-Myb的表达，结果显示，与对照组相比，c-Myb的表达明显升高。
　　 (3)在Raji及Daudi细胞中干扰c-Myb的表达后相关分化指标的观测利用干扰片段干扰了Raji及Daudi细胞中c-Myb的表达，real-time PCR和Western Blot检测了干扰效果，结果显示，c-Myb的表达明显降低;之后，real-time PCR和Western Blot检测了bcl-2，BCL6及PRDM1的表达，结果显示，与对照组相比，在基因水平上，BCL6的表达明显减弱，bcl-2及PRDM1的表达明显升高;在蛋白水平上，BCL6的表达明显减弱，bcl-2的表达明显升高，在Daudi细胞中出现了PRDM1的表达。
　　 5.初步探讨Burkitt淋巴瘤hsa-miR-150表达紊乱的机制(1) c-Myc在Raji，Daudi及相应细胞亚系细胞中表达Western Blot检测了c-Myc在Raji，Daudi及相应细胞亚系细胞中表达，结果显示，c-Myc在Raji，Daudi细胞均高表达，与Raji，Daudi细胞及对照组相比，Raji-miR-150及Daudi-miR-150细胞c-Myc的表达明显降低。
　　 (2)干扰c-Myc表达后miR-150的表达在Daudi细胞中干扰掉c-Myc表达，real-time PCR检测了干扰效率，结果显示，c-Myc表达明显下降;real-time PCR检测了miR-150的表达，结果显示，miR-150的表达明显升高。
　　 结论
　　 1.hsa-miR-150与c-Myb在人类不同分化阶段B细胞淋巴群中的表达呈阶段性及动态性，且表达模式相反;在人类淋巴瘤细胞株中，hsa-miR-150低表达，c-Myb高表达，二者的表达模式也相反。
　　 2.hsa-miR-150再表达对EBV阳性和EBV阴性的Burkitt淋巴瘤的生物行为具有不同的影响。
　　 3.hsa-miR-150再表达可以诱导EBV阳性的Burkitt淋巴瘤Raji和Daudi细胞系向浆细胞方向分化，而对EBV阴性的Burkitt淋巴瘤Ramos及BJAB没有影响。
　　 4.hsa-miR-150通过调节其靶基因c-Myb的表达发挥作用。
　　 5.c-Myc的表达紊乱可能导致了hsa-miR-150在Burkitt淋巴瘤中的表达紊乱。
　　 创新之处
　　 1.揭示了hsa-miR-150与c-Myb在人类不同分化阶段B细胞淋巴群呈阶段性及动态性表达。
　　 2.提出了hsa-miR-150再表达可诱导EBV阳性的Burkitt淋巴瘤向浆细胞方向分化，而对EBV阴性的Burkitt淋巴瘤没有影响。
　　 3.验证了在EBV阳性的Burkitt淋巴瘤中，hsa-miR-150通过调节其靶基因c-Myb的表达发挥作用。

目录

摘要

前言

参考文献

技术路线

第一章 hsa-miR-150和c-Myb在人扁桃体B淋巴细胞亚群和不同淋巴瘤细胞系表达

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第二章 构建上调miR-150的EBV+和EBV-Burkitt淋巴瘤细胞亚系

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第三章 hsa-miR-150再表达诱导EBV+Burkitt淋巴瘤细胞再分化

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第四章 hsa-miR-150／c-Myb诱导EBV+Burkitt淋巴瘤细胞再分化的机制

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第五章 初步探讨在EBV+Burkitt淋巴瘤中hsa-miR-150表达紊乱的机制

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

全文总结

攻读学位期间研究成果

致谢

声明

统计学证明