基于P颗粒的诺如病毒GⅡ.4型流行株进化机制及免疫保护研究

摘要

诺如病毒(NoVs)是世界范围内流行性急性胃肠炎的最主要病原体之一。无论发达国家还是发展中国家，各个年龄段中NoV都有很高的感染率。美国疾病控制中心(CDC)估计，仅美国每年有至少2300万例NoV导致的病毒性胃肠炎病例，每年因NoV胃肠炎导致直接治疗费用和间接所致的经济损失达数亿美元。
　　 由于缺乏细胞培养系统，亦无合适的动物感染模型，一直以来NoV发病机制研究进展缓慢。目前尚缺乏针对NoV胃肠炎的有效疫苗及抗病毒药物。近年来，随着国外学者对NoV基因组结构和衣壳蛋白研究的日益深入，24聚体的P颗粒成为该领域的研究创造了物质基础和新的研究思路。利用P区域蛋白(P颗粒)与生物合成的人类组织血型抗原(HBGA)受体抗原（A型/B型三糖）进行共结晶的晶体学结构研究，结果表明其受体结合位点位于P2亚区，即P区域的最外端。P颗粒具有与VLPs相似的立体空间结构，及天然结合宿主HBGA受体特性和高免疫原性，提示P颗粒可用于探索NoV受体结合及疫苗研制的理想模型。
　　 本研究在开展了1974-2012年间流行的NoV优势株GⅡ.4型毒株的基因遗传分析基础上，以表达的P颗粒为主要研究对象，进行了不同时期GⅡ.4型毒株P颗粒与HBGAs受体的结合方式和不同毒株的抗原关联性研究。旨在讨论宿主受体因素及宿主免疫因素在GⅡ.4的进化中所起的作用，为制定NoV疫苗策略提供依据。同时研究了抗P颗粒单价及抗P-VP8*嵌合P颗粒双价IgY抗体在NoV及轮状病毒(RV)感染中的被动免疫保护作用。
　　 （一）HBGAs受体选择在GⅡ.4型NoV流行进化中的分子机制研究NoV的遗传基因和抗原性呈高度多样性，根据病毒RNA聚合酶编码区核苷酸或外壳蛋白区氨基酸序列的差异可将NoV分成5个基因组。其中GⅠ、GⅡ、GⅣ基因组主要感染人类，GⅡ、GⅢ、GⅣ和GV组可分别感染猪、牛、犬及鼠。GⅠ、GⅡ又可以进一步细分为至少8和21个基因型，每个基因型包括多个变异毒株。自上世纪90年代中期开始，GⅡ.4基因型持续高流行。仅此一个基因型别就占了NoV世界范围内流行的60％以上，且每隔1-3年便产生新的变种，据此，有学者提出宿主免疫选择可能是导致NoV不断进化的因素之一。
　　 然而，我们团队通过前期研究提出HBGA受体对GⅡ.4型NoV分子进化的强选择是其分子进化的重要机制的假说:即在宿主变异的推动下，病毒的抗原性持续的改变;同时HBGAs作为趋同因素，通过对病毒结构的限制起到功能性的选择作用，即HBGA受体选择在GⅡ.4 NoV分子进化中亦发挥着重要作用。为了进一步阐明并验证该假说，本研究对1974-2012年间流行的82株GⅡ.4型病毒株进行了遗传分析，HBGA受体结合域氨基酸保守性分析显示该区域氨基酸高度保守:S343(100％，即82株第343个氨基酸100％为S)，T344(100％)，R345(100％), D374(100％), S441(100％), G442(98.8％)和Y443(100％),结果表明NoV表面的HBGA受体结合区域高度保守。基于目前可获得的NoV晶体结构基础上进行序列深入分析，发现GⅡ.4 NoV的HBGA受体结合界面形成了高度保守的口袋样受体结合域并能与HBGA抗原的重要位点结合。口袋样受体结合域周围则存在相对具有变异性的结构，该变异性结构主要负责与HBGA抗原的另外一个寡糖结合。
　　 利用大肠杆菌表达系统表达2000-2012年间加拿大阿尔伯特地区流行的10株GⅡ.4型NoV P颗粒（其中6株为新现的2008b和2010基因簇），通过唾液HBGA结合鉴定及人造寡聚糖（生物合成）HBGA结合鉴定实验表明:虽然不同株别的P颗粒结合A、B、H抗原的亲和力存在不同程度的差异，但所有10株GⅡ.4 NoV均能结合分泌型HBGA。由于分泌型人群占到总人群的80％-85％，GⅡ.4的高流行与其与HBGA的结合谱相一致，说明GⅡ.4高流行正是在HBGA的选择下NoV长期进化的结果。
　　 在此基础上，我们利用GⅡ.4志愿者攻毒试验获得的配对血清开展了血清学抗原性分析，研究发现1998-2012年间14个变异株之间存在显著的交叉抗原性，通过HBGA受体阻断实验(NoV体外中和实验替代模型)亦发现志愿者血清对不同毒株具有交叉阻断能力，提示GⅡ.4感染产生的抗体对不同变异株存在交叉保护作用。
　　 研究结果为GⅡ.4型NoV分子进化机制及疫苗研制策略提供了进一步的实验数据和理论基础。即:①高度保守的口袋样受体结合域为宿主HBGA受体因素强选择的结果，这将为研制抗GⅡ.4 NoV疫苗提供重要依据;②序列中变异区域为HBGA和宿主免疫共选择的结果。同时由于GⅡ基因组NoV的HBGA口袋样受体结合域亦相对保守，进一步深入研究GⅡ NoV抗原交叉反应性将为下一步研制更为广谱的NoV疫苗提供依据。
　　 （二）抗NoV P颗粒单价IgY抗体的制备及其HBGA受体阻断作用
　　 被动免疫是预防和治疗感染性疾病的有效策略。利用哺乳动物血清中提取的抗体进行口服治疗的研究已有报道。但是，由于在哺乳动物中进行大规模生产抗体的花费高，使得其应用一直受到限制。与多克隆抗体相比，用单克隆抗体进行被动免疫所产生的保护水平也较低。鸡IgY由于其生产成本低、产量而成为是被动保护抗体的一种有效选择。近几年，多个研究表明鸡IgY对粘膜病原体，特别是病原体引起的肠道内感染非常有效。
　　 本研究采用NoVs P颗粒蛋白免疫来航鸡，制备了NoV特异性IgY抗体。结果显示:鸡蛋蛋黄中自第3周开始产生特异性抗体，到第7周抗体滴度达到最高并一直持续到第16周，抗体滴度达到200，000-500，000，平均每个鸡蛋中NoVs特异性抗体含量高达4.7-9.2mg。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹(Westernblot)实验表明从蛋黄中分离的IgY抗体与NoVs P颗粒有很强的免疫反应，并且能阻断NoVs病毒样颗粒(VLPs)及P颗粒与HBGA受体结合(NoV体外中和实验替代模型)，BT50为1∶800。鸡IgY在70℃温育30分钟或者在pH4-9的环境中处理3小时后仍能保持80％以上的HBGA受体阻断活性。NoVs IgY抗体滴度高、产量高，具有在胃肠道中稳定性好、成本低廉等特点，为抗NoV感染的被动免疫治疗提供了潜在的应用前景。
　　 （三）抗P-VP8*嵌合P颗粒IgY抗体的制备及其对NoV/RV的双价免疫保护作用
　　 轮状病毒(RVs)和NoVs是导致病毒性腹泻最主要的两种病原体。RVs每年在世界范围内引起1.385亿婴幼儿严重腹泻，包括造成2500万的就诊量，超过200万的住院量和453，000五岁以下儿童死亡。RVs和NoVs在儿童和/或老年人中引起严重的疾病，并在免疫受损的病人中造成持续性感染。因此，被动免疫策略来控制和预防临床RVs和NoVs的感染是有必要的。
　　 本研究利用P-VP8*嵌合P颗粒蛋白免疫来航鸡，成功大规模制备了抗人类NoVs和RVs的双价特异性IgY抗体。在首次免疫后第二周的血清和第四周的蛋黄中就检测到P-VP8*抗体，特异性抗NoV抗体滴度与单独用NoV P颗粒免疫获得的抗体滴度相似(750，000-800，0000)，而其抗RV VP8*抗体滴度(～80，000)显著性高于单独用VP8*抗原免疫获得的滴度(～48，000)。Western blot分析结果表明抗P-VP8* IgY与NoV VLP和RV VP8*具有特异性反应。HBGA受体阻断实验表明:抗P-VP8* IgY具有阻断NoV与HBGA受体A、B抗原的结合能力（BT50为1∶1，200-1∶1，300）;同时具有阻断RV与HBGA Leb(BT50为1∶80)及H-1抗原（BT50为1∶240）的结合能力。RV体外中和蚀斑实验及免疫荧光实验显示抗P-VP8* IgY可阻断Wa毒株的体外复制（IC50为0.304 mg/ml）。利用CPE及Western blot分析，发现抗P-VP8* IgY对体外RV病毒接种前（预防）、接种后（治疗）复制具有抑制作用。研究结果表明P-VP8*诱导的IgY具有开发出一种同时有效预防和治疗NoV和RV感染的免疫制剂的应用前景。

目录

摘要

第一部分 文献综述及前言

一、NoV基因组学

二、NoV疾病负担及流行病学

三、NoV和HBGAs受体的相互作用

四、NoV P颗粒

五、IgY的研究进展

六、本论文研究的目的及意义

第二部分 HBGAs受体选择在GⅡ．4型NoV分子进化中的作用机制研究

一、1974-2012年间GⅡ．4型NoV主要流行株的序列分析

二、不同时期GⅡ．4型NoV变异株P颗粒的表达及鉴定

三、P颗粒结合HBGAs受体特征及其抗原相关性分析

四、讨论及结论

第三部分 抗NoV P颗粒单价IgY抗体的制备及其HBGA受体阻断作用研究

一、材料与方法

二、结果与分析

三、讨论及结论

第四部分 抗P-VP8＊嵌合P颗粒IgY抗体的制备及其对NoV／RV的双价免疫保护研究

一、材料与方法

二、结果与分析

三、讨论及结论

全文小结

参考文献

附录1：中英文对照缩略语

在读期间发表的研究论文

致谢

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统计学证明