TRPC1在fMLP诱导嗜中性粒细胞定向移动中作用的研究

摘要

研究背景：
　　 人嗜中性粒细胞在血液中占白细胞总数的60％-70％，是机体先天免疫应答的重要组成部分，处于机体抵御外来微生物病原体，特别是化脓性细菌入侵的第一道防线。定向移动是真核细胞的基本生物生理学特征，包括极性化和趋化两部分。细胞极性（cell polarity）对正常细胞尤其是人嗜中性粒细胞的迁移，细胞质分裂以及细胞分化等生物学过程起到关键性的作用。目前所说的细胞极性是指细胞为了行使某些特殊的生理功能或产生定向的分化，位于胞内的信号分子产生不对称分布致使细胞在形状上产生不对称性，具体表现为胞内蛋白质和脂质等信号物质不对称分布，细胞骨架、胞内其他物质发生重构。极性细胞外形特征是形成宽大的头部即是伪足，狭窄的尾部称为尾足。细胞趋化(Cellchemotaxis)是指细胞感受到内外源趋化物质，并且能顺着趋化物质浓度梯度到达趋化物质所在的部位，从而发挥生物生理学作用。所以，定向移动是中性粒细胞基本的功能。
　　 中性粒细胞具有较强的定向迁移能力，一旦感知趋化物质的存在，细胞便能迅速形成以头部宽大，尾部狭窄为特征的极性形态，到达趋化物质存在的地方，发挥杀菌抗炎作用。尽管中性粒细胞生理功能如此重要，但中性粒细胞发挥定向迁移（趋化），杀菌抗炎作用的前提是依赖于极性的形成。定向迁移的基础是细胞发生极性化，在极性化的基础上进行趋化。但在中性粒细胞建立并维持极性形态的过程中，任何信号分子的调控失败都会导致其生理功能异常。临床上一些疾病如哮喘、败血症、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、过敏反应及一些由于感染引起的器官衰竭反应等都与中性粒细胞极性功能增强或减弱导致的定向移动异常密切相关。因此，研究调控中性粒细胞极性化和趋化性形成的分子机制，对防止和治疗中性粒细胞功能异常导致的机体组织损伤具有重大的药理和临床意义。
　　 近年来，研究细胞胞内游离钙浓度（cytosolicfree Ca2+concentration，[Ca2+]i）和分布的变化参与中性粒细胞多种功能的调节，如极性化趋化等已成为热点。已有文献报道人中性粒细胞由于缺乏电压门控钙通道(voltage-gated calciumchannels，VGCC)，细胞的外钙内流主要由内质网钙库清空引起质膜上的钙通道开放导致外钙内流，这就是所谓的钙库操纵钙离子通道(store-operated Ca2+entry，SOCE)。目前除了STIM1和Oria1蛋白是组成SOCE的两种必需蛋白分子，大部分学者认为SOCE另一个重要的候选分子是瞬时受体电位通道(transientreceptor potential channel，TRP)中C家族成员TRPC1（TRP-canonical1）分子。TRP被认为可能是钙库操纵性钙通道的分子基础，原因可能是它与胞内钙离子浓度变化密切相关而且可能被其激活，TRPC是TRP家族的主要成员之一，在哺乳动物体内有非常广泛的表达，TRPC包括7个亚型，TRPC1-7，各亚型的分布与功能有所差别。其中TRPC1分布很广，在骨骼肌、肾脏、脑、皮肤、肺、前列腺、心脏、睾丸和卵巢里都有高水平表达。在哺乳动物中最早被发现的TRP通道是TRPC1，其公认的作用是钙依赖的分泌、收缩和参与受体介导。TRPC1通常和包括PLC和IP3受体等蛋白组成信号复合物参与细胞信号转导，这种复合物的功能通过在胞膜的特定脂质环境上组装得到实现。作为SOCE重要的候选分子，TRPC1蛋白是细胞膜上非选择性钙通道，目前对TRPC1在极性化以及趋化过程中的作用研究很少，尤其是从膜电流角度去分析TRPC1的作用就更少。因此，利用膜片钳技术从电生理学的角度去研究TRPC1在中性粒细胞极性化以及趋化过程中的作用，探讨中性粒细胞极定向移动过程中TRPC1是否参与，在这个过程中起什么作用，如果TRPC1参与定向移动，那么如何调控细胞膜电流来达到定向移动的。目前对这方面的研究不多，本课题所开展的实验就是为了回答这些问题，为研究中性粒细胞定向移动提供电生理学理论依据。
　　 目前已经证实中性粒细胞能够被大量的趋化物包括内源的趋化物激活，如白细胞介素8(interleukin8，IL-8)、血小板激活因子(pallet acticated factor, PAF)、补体成分C5a(complement component factor5a)和外源的趋化物质激活，如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)等。当中性粒细胞感知到趋化物fMLP，fMLP刺激细胞内质网钙库释放钙离子，细胞迅速朝趋化物浓度高的方向建立起一个头宽尾窄的极性形态，细胞骨架结构重构，促进极性的形成。细胞受到趋化物刺激形成极性，在这过程中细胞迅速启动胞内一系列复杂的极性信号机制，但是目前对这机制还不十分清楚，就极性过程中TRPC1如何调控极性细胞膜电流尚未见报道。本研究就是在外源趋化剂fMLP诱导人嗜中性粒细胞极性化的背景下去探讨TRPC1是否参与定向移动，如何调控细胞膜电流，对极性化、趋化过程中膜电流的影响。
　　 目的：
　　 本实验通过使用均一、低浓度的外源趋化剂fMLP作用于人嗜中性粒细胞，建立细胞极性模型。应用TRPC1蛋白抗体、阻断剂(GsMTx-4)封闭和阻断TRPC1蛋白通道，进而通过膜片钳技术记录中性粒细胞膜电容、各种处理因素TRPC1相关膜电流的变化，比较相应的电流密度，以及通过Zigmond chamber观察上述试剂对中性粒细胞极性趋化性的影响，利用Transwell小室观察TRPC1抗体、阻断剂(GsMTx-4)对嗜中性粒细胞迁移的影响，探讨TRPC1是否参与中性粒细胞极性化、趋化过程以及TRPC1在其中起什么作用，对膜电流有什么影响。
　　 方法：
　　 1.采用经典的密度梯度离心法急性分离人嗜中性粒细胞，主要包括Dextran沉降，标准的梯度密度离心和低渗裂解残存红细胞三个步骤。首先使用葡聚糖T-500（Dextran-T500）沉降红细胞，接着淋巴细胞分离液密度梯度离心，最后残存红细胞再裂解。获得的中性粒细胞进行瑞氏-吉姆萨染色和台盼蓝染色，分析中性粒细胞的纯度、活性。
　　 2.采用5步法拉制有芯微电极，并进行抛光处理，使用膜片钳相应仪器检测电极电阻。
　　 3.采用膜片钳相关仪器进行中性粒细胞封接和破膜，记录膜电容和各种处理因素后TRPC1相关电流的变化。
　　 4.在外源趋化剂fMLP存在的情况下，使用Zigmond chamber观察细胞受到TRPC1抗体作用的形态学变化。
　　 5.通过Transwell小室实验检测中性粒细胞的定向迁移率的变化。
　　 结果：
　　 1.5步拉制并经抛光处理的微电极电阻为5-7MΩ。
　　 2.人嗜中性粒细胞膜电容(Cm)为14.58 pF。
　　 3.TRPC1抗体、GsMTx-4均能引起中性粒细胞膜电流的下降，与对照组或/和fMLP组比较，电流密度变化均有统计学意义（P＜0.05）。
　　 4.TRPC1抗体能降低fMLP诱导的嗜中性粒细胞极性率。
　　 5.TRPC1抗体、GsMTx-4均能导致人嗜中性粒细胞趋化能力的降低。
　　 结论：
　　 1.TRPC1抗体和GsMTx-4均能降低fMLP诱导的中性粒细胞极性化膜电流，具有阻断细胞膜电流，进而抑制细胞定向移动的作用。
　　 2.TRPC1介导膜电流的变化，参与中性粒细胞定向移动，如果受到抑制，细胞定向趋化能力降低。

目录

摘要

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

3 数据处理

结果

1 TRPC1抗体对fMLP诱导的中性粒细胞定向迁移的影响

2 GsMTx-4对fMLP诱导的中性粒细胞定向移动的影响

讨论

全文小结

参考文献

英文缩略词表

硕士期间主要成果

致谢

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